质粒101:次级纳米胸泡工具箱

由Beth Kenkel.

Beth Kenkel.

蛋糕。elisas。免疫荧光。所有这些技术有什么共同之处?它们通常需要次抗体,经常是小鼠或兔品种。虽然抗体肯定不是“破碎”,但它们的生产确实需要持续的动物牺牲。可以有替代方法进行免疫缩编吗?输入Görlich实验室及其抗小鼠和-RABBIT IGG次级纳米型工具箱。Nanobodies就像微小的抗体一样,如果不优于所有上述列出的分子技术的抗体,但也可以在细菌中表达并用常见的蛋白质纯化方法提取。阅读了解有关纳米级的更多信息,以及它们的结构和功能与IgG抗体相比,以及如何在实验室中使用它们。


结构比较

如名称表明,纳米甲状腺均为较小的抗体。源自源自称为a的不寻常类型的IgG抗体重链抗体(HCAB),这是骆驼,骆驼,羊驼和其他骆驼独有的。在结构方面,HCAB就像标准IgG的折叠版本。有关纳米体,HCAB和传统IgG抗体结构的比较,请参见下文。

抗体和纳米谱结构的比较

功能比较

强但大:抗体的优点

抗体是巨大间接免疫检测工具的主要原因之一是它们的强信号强度。该信号强度在很大程度上较大(〜10-15nm),这允许以下发生以下情况:

一种)多重多克隆次级IgG可以与初抗体的不同表位结合。

b)抗体的每个臂具有每抗抗原结合位点,总共2个结合位点。

C)IgG足以足够的多个标签(下面的图2中的绿色圆圈)可以附着在每种抗体上。

nanobodies_fig2-3.png

但是大是双刃剑。抗体的大尺寸在靶抗原和荧光标记之间产生更多距离,这可以降低超分辨率荧光显微镜的潜在图像分辨率。它们的大小也限制了它们穿透组织的能力。因为抗体很大,并且致二价,初级和二抗不能一起孵育,而不形成大的低聚物复合物。抗体也太大,不能在细菌中表达,这意味着它们的生产需要动物牺牲,并排除与报告酶的标签或融合的基因工程。

对于多色染色,在选择一起使用的抗体时必须使用仔细考虑。最好选择在不同物种中升高的原发性抗体,或者至少来自不同的IgG亚类,使得副抗体仅识别仅识别一个一抗体。可以避免该方法使用直接抗体荧光团缀合物,但它们通常比未缀合的一抗昂贵昂贵。

试剂 凡好 cons
抗体
  • 二价
  • 多克隆
  • 可以用多个染料标记
  • 可商购
  • 不是重组;需要动物牺牲
  • 糟糕的组织渗透
  • 由于较大的标签位移而定的分辨率
  • 需要单独孵化1°和2°
  • 必须使用不同的不同物种和/或不同的IgG亚类,用于多色染色1°
  • 可能很贵
纳米级
  • 重组;不需要动物牺牲
  • 良好的组织渗透
  • 可以用多个染料标记
  • 由于较低的标签位移导致更大的分辨率
  • 通过预结合到1°,可以跳过2°孵育
  • 单价
  • 单克隆人
  • 目前只有抗兔和牧场版本
  • 不商业上可用

小但强大:纳米级的优点

尽管抗体是免疫检测的钛,但纳米级可能更适合这项工作。作为单一结构域蛋白质,它们可以在细菌中表达,使纳米模型是重组和可再生的抗IgG试剂。它们的小尺寸也允许更好的组织穿透,并降低荧光标签和靶抗原至约2nm之间的距离,这可能导致超分辨率显微镜的较高分辨率。纳米级可用多达3个染料标记,产生与标准IgG二次抗体相似的信号强度(pleiner等,图4a-c)。由于它们在不同IgG亚类和不同物种之间具有有限的交叉反应性,因此纳米胚层可用于最多3个靶标的分层标记(Pleiner等,图4D)。

与大型二抗体不同,当温育时,小纳米型不会用一抗原发性抗体。在替补席上,这导致染色方案较短,因为通过将其与标记的纳米植物孵育,主要抗体可以“标记”。在该预孵育前步骤之后,可以将初生抗体 - 纳米体混合物添加到样品中,从而消除次级抗体孵育。见下面的图4A,以比较纳米级染色与抗体的两步染色的这种一步染色。

两步抗体染色与一步纳米抗体染色

纳米级还简化了多色染色实验,因为它们不需要使用来自不同IgG亚类的主要抗体。相反,您可以用与所需荧光团缀合的次级纳米甲基酸预孵育个体初抗体。在下面的图4B中,即使具有三个IgG1抗体的染色细胞,也可以进行三倍的分致化。将抗体与与Alexa Fluor 488,Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 647一起缀合的次级纳米型,在施加到样品之前。用这种多色染色工作流染色产生与一个靶标染色的细胞产生类似的定位模式(比较图4AVS 4B中的纳米尺寸染色)。

用纳米型甲状腺染色的一步免疫染色

如何使用辅助纳米脚码工具箱

您是否准备好开始使用纳米级以获得自己的研究?伟大的!Pleiner等。通过免疫羊驼,将HCAB抗体与其血清分离,并精细筛选,优化和表征几种抗小鼠和-RABBIT纳米甲状腺,为您进行了努力工作。如果您有兴趣,您可以了解更多有关纳米码的内容这篇评论。如果您只想使用Pleiner等人中描述的纳米型,则下面概述了产生纳米型甲状腺的关键步骤;不需要羊驼。

确定要使用哪种纳米育:

下表总结了Pleiner等人的目前可用的纳米级。在挑选次生纳米型之前,重要的是回顾你的主要抗体的一些特征:物种在其中提出,其IgG亚类。一旦您了解这两个问题的答案,请参阅此表以查找正确的纳米脚体供您的工作。

物种 抗体子类 纳米脂肪 addgene质粒
兔子 n / a * TP897.

PTP1183(1X半胱氨酸)

PTP955(3X半胱氨酸)

IgG1. TP886. PTP943(3X半胱氨酸)
IgG1. TP1107.

PTP1112(1X半胱氨酸)

TP1122(3X半胱氨酸)

IgG2A. TP1129. PTP1005(3X半胱氨酸)
kappa. TP1170

PTP1174(1X半胱氨酸)

PTP1172(3X半胱氨酸)

*兔子只有一个IGG子类。

在细菌中表达纳米曲面:

表2还具有与质粒的链接,您需要在细菌中表达您的纳米粉末。请注意,纳米型进出1x和/或3x半胱氨酸品种。这是指纳米曲面的半胱氨酸位点的数量可用于特定标签的缀合(有关更多信息,请参见步骤4)。

用镍柱纯化纳米曲面:

Lyse表达纳米曲面的细菌并在镍柱上运行裂解物。由于其N末端HIS14-BDNEDD8标签,纳米级将与柱子结合。在几次洗涤之后,可以通过BDNedP1蛋白酶切割该标签,从而从柱中释放纯化的纳米级。BDNedP1蛋白酶可以使用质粒产生PDG02583。

标记纳米级:

然后通过马来酰亚胺标记用荧光染料或HRP标记纯化的纳米级。当马来酰亚胺基团与巯基(-SH)形成共价键时,发生马来酰亚胺标记,例如在半胱氨酸中发现的。可以找到马来酰亚胺酰胺共轭的HRP这里和几个马来酰亚胺共轭染料也可商购获得。

马来西亚胺标记纳米级

点击下载addgene的质粒101电子书


参考

1.养老剂,T.,Bates,M.,&Görlich,D.(2017)。抗小鼠和抗兔IgG次级纳米型工具箱。细胞生物学杂志。PubMed.PMID:29263082

2. Bates, M., Böhning, M.I., Chug, H., Görlich, D., Lee, C., Pleiner, T., Schliep, J.E., Stark, H., Trakhanov, S., & Urlaub, H. (2015). Nanobodies: site-specific labeling for super-resolution imaging, rapid epitope-mapping and native protein complex isolation. eLife. PubMedPMID:26633879pmed中央PMCID:PMC4755751

3. Muyldermans,Serge。“纳米级:天然单结构域抗体。”生物化学年度审查82(2013):775-97。PubMed.PMID:23495938。

addgene博客上的其他资源vwin.com mobile

addgene.org上的其他资源

额外资源

寻找与次级纳米胸泡工具箱一起使用的单克隆原代抗体?看看NIH的发育研究杂交瘤银行(DSHB)。1ml含抗体的杂交瘤上清液仅为40美元,比商业上可获得的抗体明显便宜。

话题:质粒101.质粒抗体

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅