质粒101:序列和连接独立克隆(SLIC)

由玛丽传动装置

玛丽传动

如果克隆方法具有个性,SLIC(序列和结扎独立的克隆)将是一个真正的反叛者。该系统不仅不使用特定现场的重组,它也不需要连接步骤!基于发现的同源重组的鲁棒系统大肠杆菌,SLIC是一种廉价,标准化和快速的多件DNA装配方法 - 阅读,了解如何在您的研究中使用它。

起点:与结扎无关的克隆

Ligation-independent克隆(LIC)在20世纪90年代首次开发。传统的限制性内切酶克隆使用的是较短的粘性末端,LIC利用T4 DNA聚合酶的外切酶活性产生了约10-12个碱基的较长“咬回”悬空。只有一种类型的dNTP会出现在反应混合物中,将外切酶活性限制在该核苷酸的首次出现。在该位置,T4将进行有利的聚合酶反应,随后由于没有其他dntp而停止。一旦分离消化,载体和插入物可以退火,形成一个有四个缺口的圆形产品,转化后很容易被细菌修复。

LIC是一种可靠的克隆方法,但它受到其序列约束的限制。10-12个底座悬垂不得含有反应中存在的DNTP,或者在该位置发生聚合,防止T4咀嚼整个10-12个碱基。因此,使用LIC通常限于专门设计的质粒。

序列和连接无关的克隆:SLIC改造

2007年,LIC收到了一个重要的更新,由Addgene储户提供斯蒂芬elldege.。他的新方法,称为序列和连接无关克隆(SLIC),消除了许多LIC的限制。SLIC的关键是同源重组的能力。在大肠杆菌,一个稳健的同源重组系统允许基于序列同源区域修复间隙和悬垂。这一过程可以通过以下两种途径之一发生:reca介导的重组或不依赖reca的单链退火。Elledge意识到,他可以通过PCR和不精确的T4外切酶活性产生不完美的“重组中间体”,克服了LIC中需要精心设计的DNA悬垂的要求。只要有足够的序列同源性(20-60 bp)来组织片段并将它们结合在一起,大肠杆菌能够“修复”质粒,产生重组DNA。在转化前孵育中加入纯化的RecA可以增强修复过程,允许SLIC用于非常少量的DNA(如3 ng)。当处理大量DNA (~ 100ng)时,不需要RecA。

SLIC的实用性

序列和结扎无关的克隆过程为了启动SLIC的克隆过程(见上图),我们将一个感兴趣的片段进行PCR扩增,添加指定的5 '和3 '同源区域。在没有dNTPs的情况下,PCR片段和线性化质粒均用T4聚合酶部分消化。在第二步,添加一个dNTP停止外切酶反应。PCR片段和质粒结合,退火,转化大肠杆菌。为了更轻松地,SLIC也与未完全合成的,或IPCR,碎片(上图的右分支)兼容。如果PCR不包括最终延伸步骤,则许多产品将具有由于不完全延伸而具有单链悬垂,并且这些片段可以诱导重组。混合PCR,显示在上图的中间分支中,也可用于制造插入物。两种PCR产物用于产生5'或3'突出的靶基因。当产品混合并退火时,25%得到的DNA将具有两个可以鲁棒地刺激重组的单链突出。

SLIC非常适合多组分组件(参见下图),因为重叠序列同源性指定多个片段的顺序,并且组件无尾。对于40个BP同源区,五件组装反应是高效的(〜80%。)十件片段组件也可以成功,但效率较低(〜20%)。多组件装配与SLIC

SLIC如何与其他克隆方法进行比较?

SLIC的局限性来自于它对单链悬垂的依赖。这些悬垂部分必须是可访问的,以便进行互补碱基配对,因此如果悬垂部分具有稳定的ssDNA二级结构,则不能使用SLIC。一个常见的例子是转录终止子的茎环结构。另一个潜在的问题是序列相似性。如果多组件组装中的片段彼此有5 '或3 '序列同源性,它们可能被错误地组装。为了克服这一限制,一种方法是执行分层组装,分多个步骤组装片段,以避免在同一反应中使用多个具有同源性的片段。在这些情况下,使用另一种克隆方法,如金门组装,也可能是有益的。

斯莱克最常见的是吉布森大会,基于同源重组的另一种克隆方法将在即将到来的质粒101柱中进一步详述。Gibson组件而不是使用T4 DNA聚合酶,而不是与杂化聚合酶和DNA连接酶组合的T5外切核酸酶。该反应在阶梯中进行,而不是切口所需的两个步骤,并且连接酶可以提高多部分组件的效率。吉布森组件发生的较高温度也可能限于碎片末端的二次结构的形成。Slic Over Gibson组装的主要优点是成本,因为T4聚合酶比Gibson组装所需的酶便宜得多。

SLIC是一种标准的多片段DNA组装方法,其成本低,适合研究人员进行大量克隆。与网关克隆不同,组装是无疤痕的,而且该方法的灵活性允许它与不同类型的pcr生成的插入一起使用。通过利用DNA修复的力量大肠杆菌,您可以组装多个片段而无需特定限制性位点或DNA连接酶!


参考

1.利用体外同源重组通过SLIC生成重组DNA。李MZ, Elledge SJ。4(3):251-6。2007年2月11日。PubMed。

2. SLIC:序列与结扎无关的克隆方法。李MZ, Elledge SJ。方法Mol Biol。2012; 852:51-9。DOI:10.1007 / 978-1-61779-564-0_5。PubMed。

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