SunTag和荧光成像

由玛丽传动装置

生物学和生活一样,多多益善。启动子中更多的转录因子结合位点导致更高的转录激活。多个核定位信号(NLS)增加蛋白输入到细胞核。在发展中SunTag技术,淡水河谷斯曼LABS利用这堂生物课,创造了一个系统来放大荧光信号。以“恒星爆炸超新星”命名的SunTag可以帮助你在荧光成像实验中提高亮度。

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荧光蛋白融合

追踪特定蛋白质最简单的方法之一是将它与荧光蛋白融合。然后你可以研究蛋白质定位在哪里,以及它的定位和表达如何在各种条件下发生变化。然而,这个系统远非完美。例如,如果你的融合蛋白表达水平较低,你就必须增加成像时间以获得足够的信号。这种变通方法存在细胞光毒性的风险,并消除了长期成像研究的可能性。相反,如果你在较高水平下过表达你的蛋白质,你就有可能观察到只有在蛋白质浓度非常高时才会出现的人为现象。过表达蛋白也有可能形成聚合物可能对细胞有毒。

SunTag来了

SunTag如何解决这些问题?不是直接将荧光蛋白融合到你想要的蛋白质上,而是将它融合到合成的SunTag支架上。该支架包含10-24个短表位GCN4的拷贝。GCN4招募GFP融合到同源scFV抗体,该抗体从一个单独的质粒表达。该系统可以放大荧光信号的强度,在不影响蛋白质功能的情况下实现活细胞内单分子跟踪,从而创建细胞内过程的单分子报告。最初,Tanenbaum等采用可溶性标记GB1的超级文件夹GFP (sfGFP)对GFP进行了还原。在SunTag的命名中,GFP指的是sfGFP-GB1。
比较传统的GFP融合蛋白与SunTag融合蛋白

Tanenbaum等人检测了SunTag对单分子成像的能力,发现以质膜为靶点的cax -SunTag比sfGFP亮18倍!高的SunTag信号使他们能够将激光功率削减80%以上,同时仍能以较低的光漂白率获得较高的信噪比。考虑到SunTag的强大功能,他们尝试在细胞核和细胞质中进行单分子成像。他们再次发现,SunTag非常有效地标记了单个分子——他们甚至成功地跟踪了运动蛋白驱动蛋白在微管中的运行长度。

Tanenbaum等人随后检验了他们的假设,即SunTag结构的低表达水平会避免对细胞生理的负面影响。发现线粒体追踪器GFP-mitoNEET可以损害线粒体功能后,他们检测了mitoNEET-SunTag-GFP的作用。正如预期的那样,他们获得了没有细胞器毒性的线粒体的明亮图像。

第一代(v1) SunTag表达量很低,这是由于GCN4支架稳定性差。为了增加表达量,Tanenbaum等人对GCN4序列进行了修饰,以增加其α -螺旋结构和稳定性,创建了v4 SunTag。由于v4系统不显示蛋白质聚集,它被推荐用于大多数成像应用。

你可以用圣塔格做什么?

Tanenbaum等人在他们的论文中进行了各种不同的实验,你也可以!在几乎任何情况下,你会使用一个传统的FP融合,一个SunTag融合也可以使用。

与传统荧光蛋白相比SunTag的优点vwin德赢娱乐平台

  • 提高亮度和信噪比
  • 减少光毒性的几率
  • 降低了光漂白
  • 简化的,长期的单分子跟踪

警告的SunTag

  • 非常大的尺寸:一个完全被GFP占据的24倍支架的分子量为1400 kDa,而单独使用GFP的分子量为24 kDa。虽然传统的FP融合也会影响蛋白质活性、半衰期或定位,但SunTag对这些影响更大。
  • v1 SunTag表现出一些脚手架聚集(v4 SunTag没有)。

你可以根据不同的蛋白质来决定SunTag在你的实验中的适用性。然而,由于Addgene的许多SunTag质粒都觊觎“蓝色火焰”,显然该系统可以广泛应用于许多研究领域。除了荧光,SunTag也可以用来改善CRISPR-based激活目标基因,但我们要把这个应用留到以后!


参考文献

1.一种用于基因表达和荧光成像信号扩增的蛋白质标记系统。细胞159(3)(2014): 635 - 46所示。PubMedPMID: 25307933。公共医学中心PMCID: PMC4252608

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