Suntag和荧光成像

由玛丽传动装置

玛丽传动

在生物学中,生活中,往往更好。启动子中更多的转录因子结合位点导致较高的转录活化。多种核定位信号(NLS)增加蛋白质进入细胞核。在开发他们的时Suntag技术, 这韦斯曼实验室采取了这种生物课,并创建了一个系统以放大荧光信号。命名为“恒星爆炸超新大”,SunTag可以帮助您在荧光成像实验中调高亮度。

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荧光蛋白融合

跟踪给定蛋白质的最简单方法之一是融化给荧光蛋白质。然后,您可以研究蛋白质的定位,以及其本地化和表达如何在各种条件下变化。但是,这个系统远非完美。例如,如果融合蛋白在低水平下表达,则必须增加您的成像时间以获得足够的信号。这种解决方法风险蜂窝光毒性,并消除了长期成像研究的可能性。如果您在更高的水平下过度表达蛋白质,则风险仅在蛋白质处于非常高的浓度时观察伪影。过表达蛋白也有潜力形式汇总并且可能对细胞有毒。

这里是suntag

SunTag如何解决这些问题?而不是直接将荧光蛋白融入您的蛋白质,而不是将其融合到合成的Suntag脚手架上。该支架含有10-24份的短表位GCN4。GCN4招募GFP融合到同源SCFV抗体,其从单独的质粒表达。该系统放大了荧光信号的强度,并使活细胞内的单分子跟踪在不影响蛋白质功能的情况下,从而产生细胞内方法的单分子报告。原来,Tanenbaum等人观察到一些GFP聚集,它们通过使用小溶解度标签GB1使用超细粘合剂GFP(SFGFP)来降低。在整个博客文章的其余部分的Suntag命名中,GFP指的是SFGFP-GB1。
将传统的GFP融合蛋白与SunTag融合蛋白相比

Tanenbaum等人。检查单分子成像的Suntag的力量,发现血浆膜靶向Caax-SunTag比SFGFP更亮18倍!高SunTAG信号允许它们以超过80%将其激光功率降低,并且仍然获得较低的光漂白率的信噪比。鉴于SunTag的力量,他们在细胞核和细胞质中尝试了细胞内深度的单分子成像。同样,他们发现SunTag非常有效地标记单个分子 - 甚至甚至设法轨道横跨微管的电机蛋白kinesin的运行长度。

Tanenbaum等人。然后测试了他们的假设,即SunTag构建体的较低表达水平将避免对细胞生理学的负面影响。已经看到线粒体跟踪器GFP-Mittoneet可以损害线粒体功能,他们检查了Mitoneet-SunTag-GFP的影响。如预期的那样,他们获得了没有细胞子毒性的线粒体的明亮图像。

由于GCN4支架的稳定性差,第一代(V1)SunTag表示在非常低的水平。增加表达,Tanenbaum等人。修改了GCN4序列以增加其α-螺旋结构和稳定性,从而创建V4 SunTag。由于V4系统不显示蛋白质聚合,因此建议用于大多数成像应用。

你能用suntag做什么?

Tanenbaum等人。在纸上表演了各种不同的实验,所以你可以!在几乎任何情况下,您将使用传统的FP融合,也可以使用SunTag融合。

与传统荧光蛋白相比,Suntag优缺点vwin德赢娱乐平台

  • 提高亮度和信噪比
  • 较少的光毒性的机会
  • 减少光佛
  • 简化,长期单分子跟踪

Suntag的警告

  • 非常大的尺寸:24倍的支架与GFP完全占用的分子量为1,400kDa,单独用于GFP的24kDa。虽然传统的FP融合也可以影响蛋白质活动,半衰期或本地化,但这些问题与SunTag都更大。
  • V1 Suntag展示了一些脚手架聚集(V4 Suntag没有。)

由您可以在蛋白质基础上确定SunTag在实验中的适用性。然而,由于许多addgene的Suntag质粒垂涎了“蓝色火焰”,很明显,该系统广泛适用于许多研究领域。超越荧光,Suntag也可用于改善基于CRISPR的激活靶基因,但我们将保存申请另一天!


参考

1. Tanenbaum,Marvin E.等人。“基因表达和荧光成像中的信号放大蛋白标记系统。”细胞159(3)(2014):635-46。PubMed.PMID:25307933.。pmed中央PMCID:PMC4252608.

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