质粒101:启动子区 - 让我们走!

由肯德尔摩根

Plasmid_Map一旦你知道了质粒是什么一般来说,是时候看看它的一些部分了。元素,如抗生素抗性基因起源的复制是复制质粒并确保细胞保持质粒的必要条件。在这里,我们将介绍启动子,这是让质粒表达我们感兴趣的基因所必需的。这种元素负责启动插入物到RNA中的转录。

在实践中,术语“启动子”描述了启动子(RNA聚合酶结合位点)和操作者(响应元件)的组合。启动子长约100至1000个碱基对,并在其靶基因的上游发现。启动子区域的序列控件的绑定RNA聚合酶和转录因子,因此,启动子在决定你感兴趣的基因何时何地表达方面起着重要作用。

RNA聚合酶(s)

RNA是用RNA聚合酶(RNAP)从DNA转录出来的。在细菌中,这是由一种酶完成的;然而,真核生物有多个聚合酶,每个聚合酶负责特定的rna子集。为了获得这种特异性,真核RNAP可以识别并结合特定的启动子元件。这意味着启动子在你的质粒骨架如果你想要mRNA(用于基因表达),你需要使用RNAP II启动子,而小RNA(如shRNA)是从RNAP III启动子转录的。这篇文章介绍了RNAP II和RNAP III一般转录的启动子;然而,使用病毒LTRs作为RNAP II启动子通常用于慢病毒和逆转录病毒的构建,我们将在未来关于病毒载体部分的文章中讨论这些。

启动子特异性

除了根据RNA转录本的类型选择启动子外,你还需要确保你的质粒有一个适合在宿主体内工作的启动子。因为不同细胞类型或生物体的转录机制不同,所以启动子也必须是相同的变量。细菌促进剂仅在原核细胞中工作,通常只有在衍生的相同或密切相关的物种中。类似地,各种真核细胞类型(哺乳动物,酵母,植物等)需要独特的启动子,并且交叉极少。一般来说,细菌中的启动子的多样性和复杂性较低,其组成部分比真核细胞中少。有些促销员一直都是积极主动的,而另一些促销员则受到更仔细的控制。受调控的启动子可能只在特定的组织中或在发育的特定时期起作用,或者可能有办法通过化学、热或光随意打开或关闭它们。在细胞中,启动子本身还受到其他调节因素的控制:增强子、边界元件、绝缘体和消音器;然而,一些“漏”转录可能发生。对于细胞来说,这通常不是一个大问题,但如果你感兴趣的基因有毒,它可能会扰乱研究结果,甚至杀死你的细胞。为了对抗这一问题,科学家们创造了新技术人工合成的启动子,通常包括其他启动子元素的一些组合,并倾向于更严格的调控。

真核生物和原核生物的共同启动子

我们在下面列出了以下两个参考表,列出了一些最常见的细菌和哺乳动物启动子。这些列表绝不是详尽无遗的,但应该是在试图选择完美的推动者时开始的好地方!

真核生物启动子

启动子 主要用于 RNA转录人 描述 表达式 额外的注意事项
巨细胞病毒 一般表达式 MRNA. 来自人类巨细胞病毒的强哺乳动物表达启动子 本构 可能包含增强区。可以在某些细胞类型中沉默。
EF1a 一般表达式 MRNA. 来自人类延伸因子1 α的强大哺乳动物表达 本构 倾向于给予一致的表达,不论细胞类型或生理。
SV40 一般表达式 MRNA. 猴空泡病毒的哺乳动物表达启动子40 本构 可能包括一个增强器。
PGK1(人或小鼠) 一般表达式 MRNA. 哺乳动物启动子磷甘油e激酶基因。 本构 广泛表达,但可能因细胞类型而异。倾向于抵抗由于甲基化或去乙酰化引起的启动子下调调控。
哥伦比亚大学 一般表达式 MRNA. 来自人类泛素C基因的哺乳动物启动子 本构 顾名思义,这种促进剂无处不在。
人类β-肌动蛋白 一般表达式 MRNA. 哺乳动物启动子β肌动蛋白基因 本构 无处不在。鸡肉版本通常用于启动子杂交。
CAG 一般表达式 MRNA. 强杂交哺乳动物启动子 本构 包含CMV增强子,鸡肌动蛋白启动子,兔球蛋白剪接受体。
混乱关系 一般表达式 MRNA. 四环素反应元件启动子 诱导四环或其衍生物。 通常含有一个最低的基础活性的启动子和几个四环素操作符。转录可以被开启或关闭,这取决于所使用的tet transactivator。
“无人飞行系统” 一般表达式 MRNA. 果蝇启动子锥体锥形gal4结合位点 具体的 需要Gal4基因的存在来激活启动子。
Ac5 一般表达式 MRNA. 果蝇Actin 5c基因的强昆虫启动子 本构 常用于果蝇的表达系统。
Polyhedrin 一般表达式 MRNA. 来自杆状病毒的强昆虫启动子 本构 通常用于昆虫细胞的表达系统。
CaMKIIa 邻戈的基因表达 MRNA. Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子 具体的 用于神经元/中枢神经系统表达。由钙和钙调蛋白调节。
GAL1 10 一般表达式 MRNA. 酵母菌相邻,分散转录的启动子 与半乳糖诱导;与葡萄糖阻遏 可单独使用或一起使用。由GAL4和gal80调控。
TEF1 一般表达式 MRNA. 酵母转录延长因子启动子 本构 类似于哺乳动物的EF1a启动子。
GDS 一般表达式 MRNA. 强酵母表达启动子甘油醛3-磷酸脱氢酶 本构 非常强,也叫TDH3或GAPDH。
ADH1 一般表达式 MRNA. 酒精脱氢酶I酵母启动子 压抑的乙醇 全长版本强,高表达。截短的启动子构成低表达。
CaMV35S 一般表达式 MRNA. 来自花椰菜花叶病毒的强植物启动子 本构 双子叶中活性较低,单子叶中活性较低,在动物细胞中有一定活性。
无论在哪里 一般表达式 MRNA. 玉米泛素基因的植物启动子 本构 在植物中高表达。
H1 小RNA的表达 成分 来自人类聚合酶III RNA启动子 本构 可能略低于U6的表达。可能在神经元细胞中有更好的表达。
U6 小RNA的表达 成分 来自人类U6小核启动子 本构 鼠U6也被使用,但可能效率较低。

原核启动子

启动子 主要用于 描述 表达式 额外的注意事项
T7 体外转录/一般表达 T7噬菌体启动子 构成,但需要T7 RNA聚合酶。 当用于体外转录时,启动子驱动意义或反义转录,这取决于它对你的基因的方向。
T7lac 高水平的基因表达 T7噬菌体启动子+ lac操作子 不诱导时可忽略基础表达。需要T7 RNA聚合酶,也由lac操作符控制。可以由IPTG诱导。 通常在pET载体中发现。V受到lac运营商的严格监管。可通过不同的诱导剂浓度调节基因表达。
Sp6 体外转录/一般表达 Sp6噬菌体启动子 构成型,但需要SP6 RNA聚合酶。 SP6聚合酶具有较高的加工性。当使用f或者在体外转录,启动子驱动意义或反义转录,这取决于它对你的基因的方向。
araBAD 一般表达式 阿拉伯糖代谢操纵子的启动子 可被阿拉伯糖诱导和抑制的在葡萄糖存在或通过抗诱导剂岩藻糖的存在或竞争结合的抗粘土抑制 较弱。常见于PBAD载体。适合快速调控和低基础表达;然而,不太适合通过不同的诱导剂浓度调节基因表达。
trp 高水平的基因表达 大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子 可抑制的 用高水平的细胞色氨酸关闭。
虫胶 一般表达式 启动子来自lac操纵子 缺失lac阻遏物(lacI或lacIq)构成的。可由IPTG或乳糖诱导。 带有s的漏的启动子omewhat弱表达。lacIq突变使抑制因子的表达增加了10x,从而加强了对lac启动子的调控。可通过不同的诱导剂浓度调节基因表达。
Ptac 一般表达式 紫胶和色氨酸杂交启动子 像Lac启动子一样受到调节 包含trpB中的-35 region和lac中的-10 region。非常紧密的监管。可通过不同的诱导剂浓度调节基因表达。一般优于单独紫胶。
pl 高水平的基因表达 噬菌体的启动子 可以是温度稳定的 通常与温度敏感的cI857阻阻器配对。
T3 体外转录/一般表达 T3噬菌体启动子 构成,但需要T3 RNA聚合酶 当用于体外转录时,启动子驱动意义或反义转录,这取决于它对你的基因的方向

虽然这个列表是一个很好的起点,但上面的表格并没有深入研究科学家可用的组织或发育特异性促进剂。质粒通常用于治疗,正如NIH研究人员所描述的,在这种情况下,识别正确的组织特异性启动子是很重要的这里


注:A. Max Juchheim对本文的写作有贡献。

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