质粒101:TOPO克隆

由Lianna Swanson.

基于拓扑异构酶的克隆(Topo Cloning)是DNA克隆方法不使用限制酶或者搭配,不需要pcr后的程序。听起来很简单吧?该技术依靠互补碱基对腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)杂交并形成氢键的基本能力。这篇文章的重点是“粘端”TOPO(也称为TOPO- ta)克隆;然而,TOPO克隆技术也适用于钝端克隆。

那么Topo克隆工作如何?

如下图所示,由于Taq聚合酶在PCR产物的3’端留下一个脱氧腺苷(A),所以在蓝色PCR产物插入物上的“A”悬垂来自于Taq聚合酶的扩增步骤。互补的“T”来自于拓扑异构酶i线性化的主干。DNA拓扑异构酶I(描述为绿色云)既可以作为限制性内切酶,也可以作为连接酶,通过剪切和重新连接超卷曲的DNA末端来促进复制。

Topo Cloning Vector.TOPO技术专门使用痘苗病毒分离的拓扑异构酶I,因为该酶可以识别DNA序列5’-(C/T)CCTT-3’,并在该序列上酶切双链DNA。这种断裂产生的能量以共价键的形式存储在被裂解的3 ' DNA链和拓扑异构酶I的酪氨酸残基(1)。如果一个来自不同DNA链的5 '羟基出现,它就会攻击这个共价键,从而连接两个DNA链并释放拓扑异构酶(2)。

目前市面上可买到的TOPO试剂盒提供带有悬垂的3´脱氧胸苷(T)残基的载体或克隆臂,这些残基共价连接到拓扑异构酶。这些试剂盒中的载体通常也将拓扑异构酶位点插入β -半乳糖苷酶盒中,以便研究人员进行研究蓝白色的筛选转换-自连接的向量最终导致生产的蓝色殖民地,不需要采摘和测序为了潜在的阳性克隆。一旦你介绍你的3 '端“A”悬伸插入,神奇的TOPO克隆发生。

基本程序

让我们分解Topo Cloning所需的步骤:

1.创建您的PCR产品:设计标准引物(不需要在末端添加独特的限制性酶切位点),并使用您喜欢的PCR协议用Taq聚合酶扩增您感兴趣的序列。

2.设置Topo Cloning反应:将PCR产物和Topo载体混合在一起。

3.室温孵育5分钟如果你打算立即转化你的反应,你可以把它放在冰上,或者你可以在-20摄氏度下储存一夜。

4.将TOPO克隆反应转化为感受态细胞:你可以使用你的标准实验方案;但是,你应该将冰的培养时间减少到5分钟(培养30分钟不会显著提高转化效率)。

5.选择并分析10白色或浅蓝色殖民地:您可以通过PCR确认您的插入物,限制消化,或者测序

专业提示

  • 不要在PCR引物中添加5 '磷酸盐;你需要那个游离的羟基!
  • 您可能希望在PCR的最后一个循环后包含额外的延长时间,以确保添加到所有PCR产品中的“A”。
  • 请记住,Taq聚合酶的错误率为3,500个碱基。通常使用具有校对功能的聚合酶代替TAQ以降低误差速率;然而,校对聚合酶也将在PCR产物中除去所有未配对的3'末端。如果您需要减少错误率,请使用其中一种方法来确保您的插入保留3'A悬垂:
    • 使用校对酶和Taq的混合物,Taq的过量比例为10:1。
    • 凝胶纯化您的PCR产品用缓冲液、Taq、dATPs 72C孵育10-15min。
  • 将PCR产品与Topo Vector混合时,您可能想要向您的反应添加额外的盐:

当PCR产物和载体Liate时,从载体中释放拓扑异构酶。然而,它可能会突出并缩小新连接的DNA。盐有助于防止拓扑异构酶I从重新绑定,这导致更完整的分子。(请注意,您添加的盐量将取决于您是否正在计划将反应转化为化学或电力大肠杆菌 -过量的盐会导致电穿孔过程中产生电弧,从而导致电穿孔失败。

  • 在室温下孵育时,不建议您超过5分钟的时间限制(据报道,孵育时间越长,转化效率越低);然而,如果PCR产物浓度较低或克隆的是一个非常大的插入物,则可能需要孵育20-30分钟。
  • 由于标准连接反应相当快,确保您在进行之前持续组织并准备下一步所需的一切。
  • 在你进行转化之前预热你的含抗生素的培养皿可能会让你在8小时内看到菌落。

参考:

1. Shuman S.“通过疫苗病毒DNA TOPOISOMERASE I介导的重组在大肠杆菌中介导的序列特异性。”Proc Natl Acad Sci U S A.1991年11月15日; 88(22):10104-8。PubMed.PMID:1658796.。公共医学中心PMCID: PMC52876

2.使用痘苗DNA拓扑异构酶的分子克隆和多核苷酸合成的新方法。舒曼S.J Biol Chem。1994年12月23日; 269(51):32678-84。PubMed.PMID: 7798275

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