vwin668病毒载体101:病毒载体元素

由马西帕特里克

慢病毒转移、包装和包膜质粒示意图

使用病毒载体的研究是有vwin668益的原因,包括但不限于:帮助difficult-to-deliver DNA进入哺乳动物细胞,增加基因转导效率,允许通过病毒pseudotyping控制细胞被感染,和易用性向量克隆和修改。在最基本的层面上,病毒载体由一个病毒基因组组成,该vwin668基因组已被改造成一种基于质粒的技术,并通过去除许多必要基因和分离病毒成分来进行安全修改。继续阅读,了解用于制造这些载体的病毒的简要描述,以及定义组成病毒载体系统的质粒内的主要元素的表格。

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在许多病毒中,只有一个子集在实验室中常用,我们将讨论三个最流行的:逆转录病毒,慢病毒,和腺相关病毒。

Gamma-retrovirus和慢病毒

逆转录病毒是一种RNA病毒,它使用逆转录酶制造DNA原病毒,可以并入宿主的基因组。科学家使用的逆转录病毒有两种常见的属:伽玛逆转录病毒(很多时候简称为“逆转录病毒”)和慢病毒。从这两个属,研究最多的类型是小鼠白血病病毒(MLV)和人类免疫缺陷病毒1 (HIV-1)。由于这些病毒是密切相关的,它们的生命周期和所需的组成部分基本相同,尽管在序列水平上存在差异。这意味着含有病毒特异性元件(如LTRs或结构蛋白)的质粒是不可互换的;然而,其他更普遍的病毒成分,如异源包膜或转录后调控元件可以跨任何一个系统使用。伽玛逆转录病毒和慢病毒之间最显著的区别是慢病毒可以同时感染分裂细胞和非分裂细胞,而伽玛逆转录病毒只局限于分裂细胞。

腺相关病毒

腺相关病毒或 AAV是一种小型细小病毒,可以感染人类和其他一些灵长类动物,但目前还不知道会导致疾病。如果AAV被专门用于感染人类细胞,它可以稳定地感染人类细胞整合在一个特定的染色体位点作为其溶原生命周期的一部分;然而,添加一个辅助病毒(如腺病毒或含有特异性病毒蛋白E1A、E1B、E2A、E4和VA的辅助质粒)将导致AAV进入溶解周期并复制。AAV至少有11种不同的血清型,可能还有更多有待发现。研究和实验中使用最多的血清型是AAV2;然而,包括物种和细胞类型在内的许多因素可能使其他血清型更受欢迎。
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常见病毒载体元素

在开发病毒载体的过程中,科学家们vwin668力求实现以下几个特点:低风险、高表达、大有效载荷能力、感染靶细胞的能力、无宿主免疫反应、易于在实验室中开发/使用。在几乎所有科学家使用的病毒表达系统中,n去掉了重要的部分,剩下的部分为了保证安全性,原生基因被分散在多个质粒上。的选择元素如何划分取决于是否需要提供组件在独联体(在同一质粒上)或者在反式(在另一个质粒上)作为你的插入物。下表列出了病毒载体系统中最常见的一些成分。

γ -逆转录病毒和慢病毒成分:

元素 质粒类型 提供吗? 目的
当你 转移 在独联体 长末端重复;U3-R-U5区位于逆转录病毒原病毒两侧(见下文)。LTRs之间的克隆容量为~8.5kb,但是大于~3kb的插入的封装效率较低。
U3 转移 在独联体 独特的3 ';病毒基因组RNA 3 '端区域(但在原病毒的5 '端和3 '端均可发现)。包含激活病毒基因组RNA转录所必需的序列。
R 转移 在独联体 在逆转录病毒/慢病毒载体的5 '和3 ' LTRs中发现的重复区域。vwin668Tat与这个区域结合。
U5 转移 在独联体 独特的5 ';病毒基因组RNA 5 '端区域(但在原病毒的5 '端和3 '端均可发现)。
5 '当你 转移 在独联体 作为RNA pol II启动子。根据定义,转录本开始于R开头,被限制,并通过U5和原病毒的其余部分。第三代载体使用杂交5'LTR与一个组成型启动子,如CMV或RSV。
焦油 转移(第二代) 在独联体 Trans-activating响应元素;位于LTR的R区域,并作为Tat的结合位点。
3 '当你 转移 在独联体 终止由5 ' LTR开始的归属,通过在R序列之后添加一个多聚a束。
cPPT 转移 在独联体

中央polypurine束;前病毒DNA合成的识别位点。我提高转导效率和转基因表达。

Psi(Ψ) 转移 在独联体 RNA被核衣壳包装的靶点。
RRE 转移 在独联体 转速响应元素;Rev蛋白结合的序列。
WPRE 转移 在独联体 土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件;通过增加核输出刺激转基因表达的序列。
呕吐 包装 在反式 包含基质、衣壳和核衣壳成分的慢病毒粒子的前体结构蛋白。
波尔 包装 在反式 含有逆转录酶和整合酶组件。
牧师 包装(第三代系统中分离的Gag/Pol质粒) 在反式 在未剪接和部分剪接的转录本内绑定Rev Response Element (RRE),以促进核输出。
包装(第二代) 在反式 Trans-activator;与TAR结合,激活LTR启动子的转录。
VSVG 信封 在反式 水泡性口炎病毒G糖蛋白;用于伪型大多数慢病毒载体的广谱性包膜蛋白。vwin668

请参阅我们之前的帖子”你的慢病毒质粒常见问题回答“或者我们慢病毒FAQ页面查阅有关慢病毒载体的更详细资料,包括生物安全常见问题。vwin668

AAV元素:

元素 质粒类型 提供吗? 目的
ITR 克隆 在独联体 末端反向重复;145基地。itr的对称性是AAV基因组有效增殖所必需的。形成t型发夹,作为病毒DNA复制的起点。包含包装所需的D区域。itr之间的克隆能力约为4kb。
代表 包装 在反式 用四种可能的变体包装蛋白质: Rep78、Rep68、Rep52和Rep40;是基因组复制和整合所必需的。来自大多数血清型的Rep蛋白可以与任何ITR血清型互换使用*
包装 在反式 具有三种变体的结构衣壳蛋白:VP1、VP2和VP3;VP1具有磷脂酶A2的活性,这可能是释放晚期核内体AAV颗粒所必需的。VP2和VP3对于正确的病毒粒子组装至关重要。确定血清型/病毒倾向。

*例外是AAV5,它需要AAV5 Rep和AAV5 itr进行包装。


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