vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:可视化亚细胞结构和细胞器

由Susanna Bachle.

就像人体由器官组成一样,细胞由被称为细胞器的室和结构组成。在一个牢房里偷窥一下来自Allen Cell Explorer的图像1)。

在研究蛋白质的功能或其在疾病中的作用时,研究人员经常分离感兴趣的蛋白质并使用生化方法检查它们,从而去除细胞的上下文。然而,通过了解活细胞内蛋白质的位置和运输,可以获得关于功能的许多知识。分析健康和患病状态之间的蛋白质定位和运输的差异也可以为疾病机制和蛋白质功能提供有趣的见解。

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准备确定您感兴趣的蛋白质的亚细胞定位

分析您感兴趣的蛋白质本地化的第一步是使其可检测到。可以使用荧光显微镜可视化 - 即使在活细胞和整个生物中也可以实现。您可以利用可用于显微镜的许多荧光蛋白(FP),通过克隆您的感兴趣的蛋白vwin德赢娱乐平台质编码荧光标签的矢量。一旦被表达为荧光蛋白融合,就有可能跟踪你的蛋白质从其生产位点到其最终目的地。例如,大多数分泌的蛋白质在内质粒网产生,在高尔基体中修饰,然后通过分泌途径在囊泡中运输到亚细胞或细胞外目的地。在生命周期结束时,蛋白质可能通过囊泡运输到溶酶体,在那里最终被降解(23.)。

一旦你创造了你的融合蛋白,验证它相对于未标记的野生型蛋白的功能是很重要的。例如,你可以通过比较来自融合本身的信号和荧光标记抗体所显示的野生型蛋白来验证融合蛋白的正确定位。

通过使用已知是细胞器的一部分或参与细胞内传输途径的“标记蛋白”,可以映射细胞的内部组织。这种映射可以通过使用靶向标记蛋白的抗体来完成,但是,在这种情况下,需要固定细胞,并且透透抗体以使抗体达到其细胞内靶标的细胞膜。因此,采用标记为FPS的良好表征标记蛋白质可以是有益的,以突出各种亚细胞结构。请参见图1主要哺乳动物细胞器和运输途径的常用标记

最好的,尽管并非总是可以使用惰性荧光蛋白融合来可视化亚细胞结构。例如,您可以使用融合到将荧光蛋白的信号序列融合给您感兴趣的荧光蛋白的荧光蛋白。

点击下图中的基因名称以查找含有特定基因的质粒。

特异性蛋白的亚细胞定位

对于酵母中的亚细胞标记,请参阅我们的质粒收集Sue Jaspersen.(家具学院)和马克普雷斯科特(蒙纳士大学)。

您可以找到更多的质粒,用于标记您的亚细胞结构的毛细胞艾伦植物科学研究所。你也可以使用全长斑马鱼褐土蛋白库从Rob Parton的实验室(昆士兰大学)观察膜贩运活动体内。

找到你的蛋白质,看看它是谁通过Colocalization闲逛 - AKA“他们关闭了吗?”

在标记蛋白质和选择的亚细胞标记蛋白质后,可以了解亚细胞结构的想法,您的蛋白质存在于其形成复合物中的其他蛋白质。这些“分封体化”研究就相同亚细胞结构或蛋白质复合物内的两种蛋白质的附近提供了见解。通过共表入标记蛋白和感兴趣的蛋白质,然后分析它们的荧光信号的相对分致化和电位重叠,可以确定复杂结构中蛋白质的位置。

为了以科学和有意义的方式解释分层实验,可以选择适当的量化方法和工具。通过简单地“看着它们”,通常不足以检查您的图像使用主观判断。现代摄像机和图像分析软件对检测人眼不可见的光信号非常敏感,并且对主观颜色强度感知无动于衷。开源图像分析软件工具可用于分层分析。一些例子包括ImageJ.P.lugins雅各COLOC 2bioimagexd.,并定制CellProfiler.管道。图像分析软件产生可用于比较不同实验设置之间的量化结果和统计数据。

在图2中给出了分层分析例(调整4.) - - -邓恩等人,2011提供定量共定位分析方法和有用的图像分析软件工具的深入回顾。

显微镜下的亚细胞分层化

陷阱,限制和专用的分层化方法

vwin德赢娱乐平台荧光蛋白是非常有用的工具,但它们并非没有局限性,并且执行良好的实验需要对FP特性的一些考虑。要了解一下是很重要的与荧光成像相关的一般问题如泄放(不同荧光信号的信道设置中的一个荧光信号的错误检测)和光佛即FP稳定。

我们还应该意识到与FPs本身的属性相关的其他问题。这些可以包括寡发的可能性,蛋白质电荷和实际分子尺寸 - 可以改变大型或带电的FP融合可以改变感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。科学家们不断更新和优化FP工具以避免这些问题。例如,参见最近开发的FPS针对不同的蜂窝环境进行了优化

由于共定位依赖于检测两个独立的荧光信号及其潜在的重叠,因此必须确保所选的帧数不相互影响,从而有可能伪造信号。作为基线规则,所选FPs的发射光谱需要得到充分的分离,最常见的是分别选择红光和绿色波长的FPs (6.)。这些以前的博客帖子帮助您使用哪个FP的决定以及如何选择FPS for Muli-Color Imaging

此外,必须记住,光学显微镜的分辨率受到光波长的限制,并且实际上是普通实验室显微镜的检测限为200nm。大多数蛋白质的大小低于10nm,因此在显微镜下检测到的分致化不能被解释为直接分子相互作用而无需进一步调查。一种通常用于分析两种分子之间相互作用的一种荧光显微镜方法,更紧密是Förster共振能量转移,烦恼

额外的机会:跟踪细胞内病原体

除了跟踪蛋白质的位置外,还可以遵循病毒和细胞内细菌的生命周期 - 看看我们的微生物资源用于荧光标记的病毒和细菌组分。例如,来自Mariette Barbier Lab的彩虹矢量可用于荧光标记各种革兰氏阴性细菌(西弗吉尼亚大学医学院7.)。

鉴定细胞复合物的亚细胞定位和组成是了解您对健康或患病细胞蛋白质的功能的重要步骤。我们希望您找到本文中讨论的资源对您的下一个本地化实验有用,并邀请您在您自己的工作中创建任何荧光蛋白构造,以便为Addgene社区提供。

下载我们这里的亚细胞本地化海报的标记!


参考文献

1。艾伦研究所质粒页面

2. Cooper Gm。2000年。细胞:分子方法。第2版

3. cureffi.org。细胞生物学04:分泌途径

4.Dunn,Kenneth W.,Malgorzata M. Kamocka和John H. Mcdonald。“在生物显微镜中评估分层化的实用指南。”美国生理细胞生理学杂志300.4(2011):C723-C742。PubMed.PMID:21209361.。pmed中央PMCID:PMC3074624

5。Bindels,Daphne S.等人。“Mscarlet:用于细胞成像的明亮单体红色荧光蛋白。”自然方法14.1(2017):53-56。PubMed.PMID:27869816

6.媒体网络网络。荧光探针的分致化

7. Barbier,Mariette和F. Heath Damron。“彩虹载体,用于宽范围的细菌荧光标记。”普罗斯一体11.3(2016):E0146827。PubMed.PMID:26937640。pmed中央PMCID:PMC4777285.

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