质粒101:酵母载体

由马西帕特里克

芽殖酵母(酿酒酵母)在我们最初的101篇质粒文章中,主要研究了一种植物体内质粒维持所需的元素大肠杆菌细胞,但载体可以广泛应用于许多不同的细胞类型和每个需要不同的元素的载体传播。这篇文章,以及未来的一篇文章哺乳动物的向量的核心复制和抗性特征酵母向量并解释它们与之前描述的细菌元素有何不同。

为什么科学家使用酵母载体?

酵母是真核生物,因此包含复杂的内部细胞结构,类似于那些植物和动物。与细菌不同,酵母可以翻译后修饰蛋白质然而,它们仍然拥有许多与原核生物相同的技术优势。这包括但不限于:快速生长,易于复制电镀和突变体分离,一个明确定义的遗传系统,和一个高度通用的DNA转化系统。与大多数微生物不同的是,酵母具有稳定的单倍体和二倍体状态,这对于遗传分析和有效的同源重组机制都很有用促进简单的基因置换/突变在实验室中使用的酵母表达质粒通常包含所有必要的成分,以允许在两者之间穿梭大肠杆菌和酵母细胞。为了在实验室中有用,载体必须包含酵母特定的复制起源(ORI)和酵母细胞中的选择手段除了细菌ORI和抗生素选择标记

酵母啊rigin复制

(请注意:这第一部分主要是关于芽殖酵母的ORIs,酿酒酵母;然而,我们也注意到了分裂酵母复制所需的一些特征,粟酒裂殖酵母,向量在最后。)

在之前的一篇文章中,我们简要讨论了细菌ORIs的调控是如何决定细菌细胞内质粒拷贝数的。同样,包含在酵母载体内的特定ORI元件决定了质粒如何在酵母细胞内复制和维持。这些元件不仅控制着每个细胞中发现的质粒的数量,而且还控制着质粒是否整合到宿主DNA中,或是否作为一个片段独立复制。酵母质粒的四种主要类型定义如下:

酵母质粒图谱
  • 酵母整合质粒(YIp)这些质粒缺乏ORI,必须通过同源重组直接整合到宿主染色体中。

  • 酵母复制质粒:这些载体包含一个从酵母染色体衍生的自主复制序列(ARS)。顾名思义,这些载体可以独立于酵母染色体进行复制;然而,它们往往是不稳定的,可能会在萌芽过程中消失。

  • 酵母着丝粒质粒:这些被认为是低拷贝载体,并包含部分ARS和部分着丝粒序列(CEN)。这些载体就像它们是独立的小染色体一样进行复制,因此通常作为一个拷贝被发现。与ARS向量不同的是,CEN向量在没有积分的情况下是稳定的。

  • 酵母外泌体质粒(是的)这些与细菌质粒最相似,被认为是“高拷贝”。一个2微米圆的片段(天然酵母质粒)允许50个以上的拷贝稳定地在每个细胞中繁殖。如果包含特定的可调节元素,这些向量的拷贝数也可以被控制(综述了在这里)。

质粒用于美国非洲酒另一方面,不需要定义良好的ORI。相反,DNA的大小和a - t含量(显然独立于已知的特定序列)决定了这些载体的复制。美国非洲酒质粒常常利用ARS来帮助提高转化效率;然而,这个区域并不一定促进复制。

酵母选择标记

历史上,科学家在处理酵母时使用营养缺陷选择而不是抗生素选择由于自发产生抗性突变体的比率很高酵母菌株对某些抗生素不敏感。营养缺陷是指有机体不能合成其生长所需的特定有机化合物。存在许多酵母菌的营养缺陷菌株,当在含有缺失营养的培养基上生长时很容易维持。科学家可以利用这些宿主突变,包括一个功能基因的副本,以补充宿主的营养缺陷。当宿主细胞生长在不含营养物的培养基上时,除非它们含有所需基因的质粒,否则就会死亡。

下表列出了酵母中一些最常用的选择标记,并提供了克服营养缺陷所需的元素以及该元素的其他用途。这Link提供了更广泛的酵母营养不良标记列表并包含相关的引用。

酵母选择标记 这种标记有助于合成什么?

Counterselection吗?

(标记基因缺失的生长基础阳性选择)

用于: 这能用于其他酵母种类吗? 这能用于大肠杆菌的营养缺陷选择吗? 额外的注意事项
HIS3 L-hisitidine 没有 酿酒酵母 没有 是的
URA3 嘧啶(尿嘧啶) 是的,克与5-FOA行。 酿酒酵母 是的,这可以补充ura4 -美国非洲酒,但互补性较弱。 是的
LYS2 赖氨酸 是的,克在包含α -氨基己二酸在无氮源时。 酿酒酵母 没有 没有
LEU2 L-leucine 没有 酿酒酵母 是的-这可以补充le1 -美国非洲酒,但必须有多份副本。 是的
TRP1 左旋色氨酸 是的,克与5-FAA行。 酿酒酵母 没有 没有 TRP1改变一些酵母表型。该标记不应用于基因破坏实验。
MET15 L-methionine和过度生产氢硫化物离子 是的,成长与甲基汞。 酿酒酵母 没有 没有 可用于颜色和生长选择,如果二价铅离子用于生长介质。
ura4 + 嘧啶(尿嘧啶) 是的,克行5-FOA *。 美国非洲酒 没有 没有 *裂变酵母中的FOA诱导突变ura5 +除了基因ura4 +。
leu1 + L-leucine 美国非洲酒 没有 没有
ade6 + 嘌呤(腺嘌呤) 美国非洲酒 没有 没有

使用营养缺陷选择时的注意事项

当然,使用营养缺陷标记作为选择手段也有一些缺点:

  1. 一种特定的选择标记需要用于缺乏该化合物的酵母菌株。因此,在实验之前,必须利用已知的营养缺陷菌株/选择元素对或创建一个新的组合。

  2. 由于高拷贝数,质粒提供的标记可能在高于正常生理水平上表达。这对酵母细胞造成了潜在的代谢负担。

  3. 由于非生理水平的选择标记的存在,一些表型可能发生改变。

科学家们尝试了各种方法来解决这些问题。一种减少标记基因表达量的方法是使用部分缺陷的启动子来驱动选择标记的表达。这减少了细胞中基因产物的数量,从而允许酵母保持更高的拷贝数。此外,抗生素选择方面的改进使得在酵母中利用更传统的药物选择方法作为营养缺陷标记的补充或替代成为可能。的MX系列抗抗生素盒式磁带最常用的是KanMX由于其广谱性和用于细菌、酵母和哺乳动物细胞的能力,是最普遍的。

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主题:酵母,质粒101,质粒

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