用CRISPR/Cas9标记蛋白质:与Mendenhall和Myers的对话

由肯德尔摩根

Eric M. Mendenhall.阿拉巴马大学亨茨维尔分校的埃里克·门登霍尔(Eric Mendenhall)解释说,他实验室的主要目标是了解基因组非编码部分的功能。门登霍尔和哈德逊阿尔法学院的理查德·迈尔斯(门登霍尔也是哈德逊阿尔法学院的兼职教员)作为哈佛大学的一员,多年来一直致力于这个目标DNA元件百科全书计划ENCODE是美国国立卫生研究院资助的一项研究,旨在确定人类基因组的所有功能元素。

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这对研究人员从一种被称为ChIP-seq的成熟方法开始,将相当多的注意力集中在转录因子上。ChIP-seq依赖于抗体来直接识别和结合转录因子,但这是一个缓慢的过程,在很多情况下都不起作用。为了追踪到每一个基因调控蛋白以及基因组中可以更快更有效地找到它们的位置,它们最近适应了CRISPR / CAS9.蛋白质标记系统。

我们与Mendenhall和Myers谈过他们的新的CRISPR标记系统,他们现在在Addgene提供。有关目前可用的质粒的更多细节以及详细的协议,请转至www.addgene.org/crispr/tagging.

Addgene:有什么动力的是,您可以在蛋白质标记中适应CRISPR?

迈尔斯:我们的实验室在几个项目上紧密合作,这是一个与基因表达有关的项目。ENCODE项目的一个目标是观察所有1500或1600个转录因子,并找出它们与基因组结合的位置。我们已经用这个叫做ChIP-seq的实验做了好几年了,但是对于很多转录因子来说真的很难。我们的团队一起将CRISPR用于标记实验,它看起来已经产生了很大的影响。我们现在可以研究更多的转录因子。

Addgene:系统如何工作?

林业局:该系统确实非常简单,但它提供了提高效率和吞吐量。在改造CRISPR/Cas系统时,我们所做的是加入第二个质粒,将表位标签靶向到转录因子上。顺便说一下,你可以用它在各种不同的检测中标记任何蛋白质,不仅仅是转录因子。

第二载体是具有同源性臂和选择标记的同源性修复供体质粒。如果事情正常工作,则第二个质粒插入转录因子结束时称为标志的小表位标签。它还给予对新霉素的细胞抗生素抗性,因此您可以使用标记的转录因子选择细胞群。

FLAG抗体已经被很好地描述了,该系统允许你将相同的抗体添加到任何蛋白质,以获得真正美丽的ChIP-Seq结果。FLAG表位非常小——20个氨基酸——所以我们认为它不会干扰蛋白质的功能。

迈尔斯:我们已经将我们的新系统与已知具有良好抗体的转录因子的标准ChIP-seq进行了比较。结果看起来几乎一样。

Addgene:您的系统在这种情况下有什么优势?

林业局:这些益处是两倍:Crispr / Cas9提供高效率,诱导双层休息和更多机会同源重组。在CRISPR之前,重组是一百万个事件中的一个。现在它可能是100或50个活动中的一个。第二质粒的克隆可以在一个组装反应中在一天内完成。这第二个质粒为您节省了几周。CRISPR为您节省了几个月。这是吞吐量越高,更快。它也很容易并行运行。

Addgene:除了快速有效,这种系统有助于解决哪些挑战?

迈尔斯:细胞内部只有一小部分蛋白质具有对它们的商业抗体。还有一个关于这些互动的具体互动的问题。这在这种CRISPR系统中解决了具有通用抗体的。它是人类或其他细胞中未发现的表位。它是人为的。这意味着你没有得到任何背景或交叉反应。我们已经为转录因子开发了这一点,但是您可能需要这样的系统有很多原因。这对我们来说真的很令人惊讶,那里没有百种不同的版本。

Addgene:为什么让这些质粒能够快速向其他科学家提供重要?

迈尔斯:我们希望弄清楚如何为数百个转录因素做到这一点。我们想要一些允许自动化的东西。这种设计削减了几周的等待和手劳动。这是一个巨大的交易。使用Addgene,现在可以使用任何可用性的成本可用,而无需从所有人开始或写信给我们。尽管我们很乐意为他们提供,但从来没有大规模工作。世界现在太大了。

林业局:很多研究小组一直在与这种抗体问题作斗争。我们认为把这些东西放出去是正确的。这是一个简单的解决方案。如果不尽快分享,那就太愚蠢了。

Addgene:你在这个新工具中看到了多少兴趣?

林业局:自从3月份冷泉港的编码财团提交以来,我们已经收到了许多要求。许多团体被兴奋,并要求协议。由于上个月加入页面上市,超过340人已在质粒可用时签约以获得警报。

我们还有一些要求我们开发的质粒的变化。我们正在努力,但系统是如此灵活。其他调查员可以轻松调整这些向量以与他们最喜欢的选择盒式配件一起使用。它们也可以从旗帜切换到GFP.或不同的表位。

Addgene:您是否有任何额外的提示,技巧或咨询的言论,可能想要将此标记系统应用于自己的工作?

林业局:我们已经准备好了协议在这里。我们经历了一些坎坷,我们希望其他团队能够避免这种情况。我们发现的一件事是,它是非常顺利的秩序的同源臂作为一个gBlocks®基因片段DNA技术集成。一般来说,任何在实验室使用CRISPR/Cas9的人都应该能够运行这个协议。

我们还想对许多其他实验室施加一些可能做一些类似的实验室的社会压力。可能还有其他变体,这对一些实验更好,而不是我们所备受的实验。我们会鼓励那些开发自己的系统或使用和调整我们的试剂的人认为将它们添加到Addgene的特殊收藏中CRISPR标签系统


感谢您与我们交谈的Mendenhall和Myers教授!

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