近距离标记:蛋白质复合物纯化和蛋白质组学作图的强大工具

由Alyssa Cecchetelli

大约有每立方微米有2-4百万蛋白质细菌,酵母和哺乳动物细胞(Milo, 2013)。这些蛋白质之间相互作用的数量仅靠研究是难以想象的。

为了阐明这些相互作用,科学家们长期使用基于抗体的亲和纯化和质谱方法。然而,最近,科学家们开发了一种新的方法,称为接近性标记,以更好地捕捉这些相互作用在大量的生物环境。

近似标记依赖于邻近蛋白质在具有生物素的细胞内的标记。生物素,是一种天然的辅酶,能与糖蛋白、亲和素或类似的蛋白质链霉亲和素强烈结合。这种强烈的相互作用使科学家可以很容易地纯化和识别任何标记生物素的蛋白质,使用亲和素包被纯化技术。由于生物素对亲和素的高亲和力,接近标记可以捕获弱/短暂的蛋白质相互作用,并可用于可溶性和不可溶性蛋白质,这对传统的基于抗体的亲和纯化/质谱方法来说是一个挑战。

生物id:一种混杂的生物素连接酶,可以有效地标记邻近的蛋白质

基于生物素的邻近标记技术,BioID,是于2012年在布莱恩伯克实验室开发的(Roux等,2012)。生物利用这一点大肠杆菌生物素连接酶,BirA*,位点突变(R11G)。该位点突变使连接酶不稳定,使活性生物素分子从连接酶解出并与相邻蛋白上暴露的赖氨酸结合。因此,为了捕获蛋白质复合物,科学家可以简单地在细胞中表达一种与BirA*融合的诱饵蛋白,然后将这些细胞与外源性生物素孵育。几个小时后,生物素化的蛋白质可以被链霉亲和素亲和珠或基质捕获。诱饵蛋白甚至可以将BirA*定位到特定的亚细胞位置,如核包膜,使科学家能够探测感兴趣位置的相互作用。

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顶点:工程化抗坏血酸过氧化物酶,可以快速生物素标记蛋白

BioID问世一年后爱丽丝婷实验室证明了工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX),作为一个基因标记用于电子显微镜,可用于高效的邻近标签(Rhee et al., 2013)。在过氧化氢存在下,APEX催化生物素-苯酚氧化为短命生物素-苯氧基。这种自由基与富含电子的氨基酸(如酪氨酸)在邻近的蛋白质上发生反应,导致它们的生物素化。APEX的优势在于它的速度,可以在几分钟内标记相邻的蛋白质,而不像BioID那样需要几个小时。APEX允许科学家识别人类线粒体基质的蛋白质组图(Rhee et al., 2013),并确定线粒体钙单转运体拓扑结构(Martell等人,2012)。重要的是要注意,生物素-酚试剂可能对活细胞有毒,因此APEX不适合有机类或体内研究(Che和Khavari, 2017)。

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邻近标记方法,生物和顶点的比较自从BioID和APEX的发展,优化版本的BioID和APEX已经开发,以及新的接近标记技术。这些更新的工具目前也可以在Addgene上使用。

BioID2:一种较小的改良的混杂生物素连接酶

Roux实验室在2016年对BioID进行了优化BioID2, 一种较小和改善的混杂生物素连接酶(Kim等人2016)。Bioid2由人源化生物素连接酶组成A. Aeolicus.的dna结合结构域(233个氨基酸)大肠杆菌的版本。它还在生物素催化域的保守残基中包含一个单一突变(R40G),允许混杂的生物素化。与BioID相比,BioID2显示出更强的近端标记,需要更少的生物素,并允许科学家更有选择性地将融合蛋白定位到细胞的特定位置。

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APEX2:用于接近标记的更敏感的抗坏血酸过氧化物酶

顶点的一个主要限制是它的敏感性低。敏感性可以随着更高的表达水平而增加,但对于许多融合蛋白,这将导致蛋白质/细胞器聚集。TING实验室假设低灵敏度是由于次优折叠或稳定性。因此,他们在它们进行了多轮定向演变之前鉴定了敏感性显着增加的突变体不影响原APEX的功能或效率(Lam et al. 2014)。他们给这个突变体命名epex2.

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TurboID和minturbo:快速和无毒的接近标记

TurboID和miniTurbo于2018年在TING LAB开发提高邻近标签的速度通过混杂的生物素连接酶(Branon等,2018)。Bioid和Bioid2可能需要数小时才能标记蛋白质和尖端,尽管它可以快速标记蛋白质,但需要对活细胞有毒的H2O2。为了规避这些问题,利用基于酵母显示的定向演变以产生两个突变体,与Bira和28kd miniturbo相比具有15个突变的35 kd涡轮增压,与缺失的n-末端结构域和13个突变相比野生型Bira。涡轮模和Miniturbo在10分钟内使生物素标记在没有任何毒性问题中。在早期的时间点,涡轮模的信号明显大于Miniturobo,但在加入外源生物素之前,Miniturbo表现出较少的标记,允许更精确的时间控制。

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分裂生物:一种蛋白质组学方法来监测蛋白质 - 蛋白质相互作用

Split-BioID结合了蛋白质片段互补(PCA)技术和邻近标记来验证二元蛋白质-蛋白质相互作用,并在一个简单的实验中识别其他相互作用的蛋白质。主成分分析是一种体内两种蛋白质融合到互补报告蛋白的技术,该蛋白质可以仅在密切接近时组装。分裂生物体包括分裂Bira *分子可以重新组装以融合到两个相互作用蛋白(Schopp等,2016)。因此,在一个实验中,科学家可以确认和监测两种蛋白质的相互作用,同时也是生物素标记和纯化来自感兴趣复合物的额外蛋白质。

欲了解更多信息,请阅读Split-BioID博客文章。

快速:rna -蛋白相互作用检测

到目前为止,我们已经介绍了研究蛋白质相互作用的方法,但是科学家也开发了检测rna -蛋白质相互作用的方法,可以调节多种生物学功能。快速(RNA-蛋白质相互作用检测)使用基于生物的邻近蛋白质标记识别rna蛋白质相互作用(Ramanathan等人,2018)。为了开发RapID,科学家们设计了一个突变体BirA*B.枯草芽孢杆菌,称为巴苏。与标准相比,BASU表现出1000倍快的动力学,并增加了30倍的信噪比大肠杆菌BirA *突变。RapID由这个突变体BirA*和一个包含感兴趣的RNA基元的RNA组件组成。任何与RNA基序结合的蛋白质都会被生物素化。

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接近标记用于检测细胞和细胞之间的相互作用

EXCELL酶介导的接近细胞标记策略是什么检测和信息交互体内(Ge等人,2019)。这种技术依赖于美国auerus转肽酶分选酶一种变体(mgSrtA),能够用小肽(LPETG)随意标记N端含有单氨酸残基的各种细胞表面蛋白。在EXCELL中,mgSrtA变体可以显示在感兴趣的细胞表面,它可以用生物素标记的LPETG肽标记相互作用的细胞表面蛋白。生物素标记蛋白可以用链霉亲和素纯化,并通过流式细胞术分离。

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自从BioID于2012年开发以来,邻近标记已经成为研究蛋白质-蛋白质相互作用,rna -蛋白质相互作用,甚至最近的细胞-细胞相互作用的强大技术。如果你正在寻找与你最喜欢的蛋白质或RNA基序的相互作用,不妨试试这些方法。

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参考:

布兰森,苔丝C.等人。“高效接近活细胞和涡轮增殖症的生物体。”自然生物技术36.9(2018): 880。PubMedPMID:30125270。公共医学中心PMCID: PMC6126969

Che Yonglu和Paul A. Khavari。研究技术变得简单:通过空间邻近阐明蛋白质相互作用的新方法皮肤病学研究杂志137.12(2017):E197-E203。PubMedPMID: 29169465

葛云等。检测细胞间相互作用的酶介导的细胞间接近标记美国化学学会杂志141.5(2019):1833-1837。PubMedPMID: 30676735

Kim,D. I.,Jensen,S.C.,Noble,K。,Kc,B.,Roux,K.H.,Motampchaboki,K。,&Roux,K.J.(2016)。一种改进的较小生物素连接酶,用于BioID接近标记。细胞的分子生物学,27(8),1188-1196。PubMedPMID: 26912792。公共医学中心PMCID: PMC4831873

林,斯蒂芬妮S.等人。“电子显微镜和接近标记的Apex2的定向演变。”自然方法12.1(2015): 51。PubMedPMID: 25419960。公共医学中心PMCID: PMC4296904

Martell, Jeffrey D,等人。工程抗坏血酸过氧化物酶作为电子显微镜的基因编码报告物自然生物技术30.11(2012):1143。PUBMEDPMID:23086203。公共医学中心PMCID:PMC3699407

米洛,罗恩。“每个细胞体积中蛋白质分子的总数是多少?”呼吁反思一些已发表的价值观。”Bioessays35.12(2013): 1050 - 1055。PubMedPMID:24114984。公共医学中心PMCID: PMC3910158

Ramanathan, Muthukumar等人。活细胞中rna -蛋白质相互作用的检测自然方法15.3(2018): 207。PubMedPMID: 29400715。公共医学中心PMCID:PMC5886736.

Roux,Kyle J.等人。“一种混杂的生物素连接酶融合蛋白鉴定哺乳动物细胞中的近端和相互作用蛋白。”J细胞196.6(2012): 801 - 810。PubMedPMID:22412018公共医学中心PMCID:PMC3308701.

Rhee,Hyun-Woo,等。“通过空间限制酶标,活细胞的线粒体蛋白质组学映射。”科学339.6125(2013): 1328 - 1331。PubMedPMID:23371551。公共医学中心PMCID:PMC3916822

Schopp,Isabel Myriam,等。“分裂 - 生物化蛋白质组学方法,用于监测现时定义的蛋白质复合物的组成。”自然通信8(2017): 15690。PubMedPMID:28585547。公共医学中心PMCID:PMC5467174

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