利用GreenGate质粒快速、多功能的植物转基因

由肯德尔摩根

GreenGate转化株几年前,研究人员介绍了用金门法克隆技术所谓的重大突破。首次,可以快速有效地组装大量的建筑物,只有两种或三种廉价酶。现在,一个新的工具包 - 恰如其名为Greengate - 为在植物模型系统中工作的研究人员提供所有相同的优势。

“克隆全部在体外完成;这在老鼠、人类和植物中没有区别。Jan Lohmann.海德堡大学。“不同的是,你用来将其带入目标生物体的质粒。我们根据先进的分子植物科学实验室的日常需求设计了金门系统。”

引入GreenGate

作为Lohmann和他的同事描述了《公共科学图书馆•综合》在12月份引入套件的论文,Greengate包括植物表达盒中最常用的六种最常用的元素:植物启动子,N-末端标签,感兴趣基因的编码序列,C末端标签,植物终端和电阻盒的选择转基因植物。这完整的绿色工具包,也提供了在随后的几轮中将多个表达片段叠加到单个T-DNA上的选项,极大地减少了产生多结构转基因植物所需的时间。

洛曼说,从最实际的角度来说,与更繁琐、更耗时的传统克隆方法相比,“绿色门”可以“为你节省半年时间”。

金门和绿门的关键成分是IIS型限制性内切酶。它们像其他内切酶一样,只是它们在距离识别位点一定距离的任意序列上剪切。换句话说,切割和识别是独立的。

“他们看了一个片段,又剪掉了另一个,”娄曼说。“它允许我们设计的模块,总是有相同的识别位点,但不同的位点酶将切割。你只需要一种酶来切割非常不同的片段。”

因为产生的碎片会有不同的突出部分,它们可以被设计成只以一种方式回到一起,并且在一个管子里。(关于GreenGate工具包及其工作原理的更多细节可以找到在这里。)虽然Lohmann表示,但他们只测试了Greengate拟南芥,原则上它应该适用于任何植物。

交易技巧

Lohmann确实有一个特别的建议给那些想在自己的实验室家中尝试这一方法的人:要非常小心IIS限制内切酶的类型选择, BsaI,这对温度波动非常敏感。他说,他们的实验室在克隆方法后学到了艰难的方式,这曾经哼过了99%的效率,只是停止工作。他们终于将问题追溯到内切核酸酶。

“它只是一种敏感的蛋白质,”他说。“除了温柔点,你别无他法。如果它不再有效,就把它扔掉。”

Lohmann和他的同事,包括Joachim Forner,现在期望并希望其他实验室将忙于GreenGate,在这个过程中生产和贡献更多的模块到公共领域。

“我们通过Addgene提供GreenGate有几个动机,”Lohmann说。“我们坚信,材料的免费共享对科学进步绝对是必不可少的。而且,使用这种系统的人越多,就会有越多的构建模块可用,使我们的工作更容易。”


参考

1.Athanasios Lampropoulos等人。绿色门——一种新颖、多功能、高效的植物转基因克隆系统。《公共科学图书馆•综合》。8(12): e83043(2013年12月20日)。

2.Carola Engler等。“一锅,一步,高通量的精确克隆方法。”《公共科学图书馆•综合》。3(11): e3647(2008年11月5日)。

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主题:植物生物学,质粒克隆,质粒

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