快速检测RNA-蛋白质相互作用

由Beth Kenkel.

Beth Kenkel.

有时它感觉像DNA和蛋白质都得到了所有的关注。有许多方法可以检测DNA-蛋白质相互作用或分析染色质状态芯片SEQ.Faire-SEQ.切断和运行)并检测蛋白质 - 蛋白质相互作用(酵母 - 两个杂交,CO-IP,生物),这只是为了命名几个。但如果你想研究RNA蛋白质的相互作用,该怎么办?RNA-蛋白质相互作用的表征已经滞后,可能是由于当前手段的限制来检测RNA蛋白质相互作用。解决这种需要,Khavari Lab.在斯坦福创建RNA-蛋白质相互作用检测(快速)方法。快速借用了大肠杆菌生物素连接酶Bira *来自BioID,并允许研究人员鉴定结合活细胞感兴趣的RNA主题的蛋白质。

现有RNA蛋白质相互作用方法的挑战

  • 不在本机环境中。虽然本地纯化保留在细胞中存在的RNA结构和天然存在的复合物,但也可以引起由于样品加工引起的非生理RNA-蛋白质相互作用。

  • 要求事先知道感兴趣的蛋白质与RNA相互作用。方法交联免疫沉淀(夹子)通过用UV光交联RNA和蛋白质来鉴定RNA-蛋白质相互作用,其次是感兴趣蛋白质的抗体下拉,非常喜欢使用芯片来研究蛋白质和DNA相互作用。遗憾的是,使用蛋白质作为诱饵具有有限的效用,用于鉴定与感兴趣的RNA相互作用的新型RNA结合蛋白。

  • 目前的标签方法并不理想体内工作。Bira *需要16-18小时才能获得足够的生物素酸酯蛋白质,这导致不良的时尚分辨率体内工作。epex2.,基于过氧化物酶的标记方法,是一种替代选择,但对组织和模型生物有毒。

检测快速的RNA-蛋白质相互作用

快速类似于BioID平台,用于鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用,但快速识别RNA-蛋白质相互作用。两种方法都依赖于混杂的大肠杆菌Biotin连接酶,Bira *,在诱饵〜10nm〜10nm内的生物素酸酯蛋白质,其用于快速是感兴趣的RNA基序。有关快速的关键组件的详细信息,请参见下面的图1。

RNA-蛋白质相互作用检测(快速)图

Ramanathan等人。还调整了Bira *以增加其生物素化率。改善的酶,称为斯巴州,来自Bira *同性恋中B.枯草芽孢杆菌。斯巴州与头部与头部比较大肠杆菌Bioid2.Bira * s在快速以检测已知的RNA蛋白质相互作用的情况下。与炒RNA基序控制相比,一分钟阵列产生强烈的链霉抗生物素蛋白信号(〜250倍))。Bioid2在同一时间点没有可检测信号。大肠杆菌在最佳18小时时间点测试了Bira *,但与Basu的标签一分钟仍然产生了> 30倍的浓缩大肠杆菌Bira *。更快的标签动力学也意味着可能使用斯大尔体内为了研究短时间内发生的RNA-蛋白质相互作用的作用,例如在药物作用或细胞信号传导期间。

迅速的局限性

与其他Bira *基于近距离标记方法一样,快速无法区分直接或间接与诱饵相互作用的蛋白质。此外,Rapid不能用于研究其生理表达水平的内源性RNA;然而,将BoxB位点敲入内源性DNA序列可以允许人们研究从原生调节元件表达的RNA。

快速实验的控制

快速阴性对照包括单独用Bira *蛋白转染的炒RNA基序和细胞(即没有RNA诱饵)。Ramanathan等人。还使用污染储存库进行亲和力纯化(雪橇),用于鉴定由进行Bira *基础亲和纯化质量规范实验的其他研究组报道的高生物素化的背景蛋白。然后从Ramanathan等人中减去这些背景蛋白。的快速数据集。

快速发现和疾病的应用

快速应用

快速听起来像漂亮的技术,但它可以帮助回答哪些问题?Ramanathan等人。概述了快速的三种应用:

  1. 发现。探索新型RNA蛋白质相互作用,Ramanathan等。设计了一种含有三个保守但不具备很好的RNA主题的RNA诱饵。该诱饵确定了新的相互作用:RC2H1蛋白与SM1V1 RNA基序的结合。它已知RC3H1及其寄生虫RC2H2是RNA结合蛋白质,其促进RNA衰减,其上调与乳腺癌患者的差存在差。通过挖掘文献并分析数据癌症基因组图集,ramanathan等。发现证据表明RC2H1蛋白表达和含SM1V1的RNA的转录后调节的证据可以在乳腺癌的严重程度中起作用。

  2. 传染病。快速也可以帮助鉴定与病毒RNA相互作用的宿主蛋白。RNA病毒,就像Zika.,通常将宿主蛋白质粘合到结合其未转换的区域(UTRS)以帮助病毒生命周期。Ramanathan等人。用力快速看看宿主蛋白与Zika的UTR互动并确定QKI.,在神经祖细胞中高度表达的RNA结合蛋白。QKI的击倒减少了Zika病毒RNA水平的90%,表明QKI是对Zika复制至关重要的宿主蛋白。

  3. 人类遗传疾病。迅速也可用于测试与人类疾病相关的RNA变体如何影响蛋白质结合模式。遗传性高温胰血症 - 白内障综合征(HHCS),一种疾病,其特征是铁血清水平增加和早发白内障,其特征在于铁响应元素(IRE)RNA转录物的铁响应元件(IRE)RNA基序中的点突变。IRE基序由IRE结合蛋白,IREB1和IREB2的约束,其后转录调节铁代谢途径转录物。通过快速,Ramanathan等。发现所有HHCS相关序列与野生型序列相比具有较低的IREB2结合富集,并且与HHCS患者中观察到的血清铁水泡增加的结合丧失相关。

这些只是如何利用如何利用速度研究RNA蛋白质相互作用的三个例子。你有一个问题可以帮助回答吗?快速质粒可从addgene获得!


参考

Ramanathan, M., Majzoub, K., Rao, D.S., Neela, P.H., Zarnegar, B.J., Mondal, S., Roth, J.G., Gai, H., Kovalski, J.R., Siprashvili, Z., Palmer, T.D., Carette, J.E., & Khavari, P.A. (2018). RNA–protein interaction detection in living cells.自然方法,15,207-212。PubMed.PMID:29400715。pmed中央PMCID:PMC5886736.

MCHUGH,C.A.,Russell,P.,&Guttman,M.(2014)。综合实验鉴定RNA蛋白质相互作用的方法。基因组生物学。PubMed.PMID:24467948pmed中央PMCID:PMC4054858.

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