无试剂盒RNA提取

由利亚Schwiesow

利亚Schwiesow2020年3月24日

和DNA分离一样，科学家们通常依靠RNA分离工具来简化他们的工作。最近，我们在DNA纯化没有套件这也概括了不使用工具箱的几个好处:更少的塑料浪费，更少的费用，以及当所有的旋转柱用完后，更少的剩下一堆随机的解决方案。在这篇文章中，我们介绍了在没有试剂盒的情况下分离RNA的基础知识。

使用RNA的技巧(无论你是否使用试剂盒)

尽管不用说，在进行任何类型的DNA或RNA纯化时都应该小心，以避免污染，但在进行RNA提取时要格外小心。RNA天生就不像DNA那样稳定——它是单链的，其核糖基团容易水解和热降解。此外，RNA酶，或降解RNA的酶，是一种特别耐劳的蛋白质，存在于包括皮肤在内的所有物质中。以下是一些使用RNA的一般技巧，即使你使用的是工具包:

一定要戴上手套，因为你手上的RNA酶可以降解RNA。
保持工作区域的清洁，这可能包括在你的工作台上喷洒去除RNaseZAP等rnase的产品。
当采集组织、细胞、植物、真菌或细菌时，保持样本低温并快速工作以减缓RNA的降解。
确保使用depc处理或RNAse免费的水。如果使用DEPC处理的水，用高压灭菌器将水灭活DEPC。
确保使用的塑料或玻璃器皿是RNase免费的。无rnase的塑料制品很容易从科学供应商那里获得，玻璃制品应该用DEPC溶液处理1小时，然后高压灭菌以去除残留的DEPC。或者，玻璃器皿可以在180°C下烘烤至少4小时。
如果你最终的RNA样本被重悬在水中或TE缓冲液中，将它们保存在-80°C的冰箱中以防止RNA降解。它们会在-20°C的冰箱中降解。

RNA提取方法演变为今天仍然使用的简单协议

有许多不需要试剂盒就可以分离DNA的替代方法。然而，RNA的提取和纯化却不是这样。有一个简单的可行方法，以及该方法的变体。开发分离RNA方案的一个主要障碍是，RNase通常在细胞中发现，如果没有什么东西来阻止RNase在细胞裂解时的活性，RNA就会降解。为了有效地分离完整的RNA，需要一种快速、强的蛋白质变性剂——在RNA酶在细胞裂解时有机会分解RNA之前，这种变性剂就能分解RNA。

20世纪70年代末，Chirgwin和他的同事们发现了一种强大的蛋白质变性剂，硫氰酸胍盐(Chirgwin et al.， 1979)。他们开发了一种从大鼠脾脏中分离RNA的方案，他们将大鼠脾脏在硫氰酸胍溶液中均质，并将匀浆旋转以去除不溶物质。然后，将匀浆置于氯化铯梯度上，超离心20小时，从DNA和蛋白质中分离完整的RNA。尽管这种方法在分离总RNA时非常有效，但它需要大量时间，而且取决于你可能有多少样本，需要使用一个或多个大的、昂贵的超离心机。

图1:RNA提取的不同步骤的概要。

20世纪80年代中期，美国国立卫生研究院的研究人员开始开发一种完全跳过超离心法的方案。Chomczynski和Sacchi等人的研究表明，RNA可以有效地从DNA和蛋白质中分离出来硫氰酸胍-酚-氯仿的简单提取方案。在这种方法中，样品仍然在硫氰酸胍溶液中均质和裂解。然而，与使用铯-氯梯度进行RNA分离不同的是，将水饱和苯酚、乙酸钠和氯仿添加到匀浆中并摇晃。在快速离心(不是超离心!)后，苯酚和氯仿层分离，RNA保留在顶部的水层，而DNA和其他蛋白质保留在间相和底部的有机层。提取顶部的水层，然后用异丙醇沉淀RNA。这种方法将分离RNA所需的时间从20多个小时减少到4个小时左右，这种无试剂盒方法的变体至今仍被广泛使用(Chomcynski和Sacchi, 2006)。

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使这个简单的协议更加简单(仍然没有工具包!)

如上所述，使用RNA需要保持样本低温直到均质和细胞裂解。这取决于你的实验室情况或组织收集方法，因此生物技术公司已经推出了一些产品，有助于进一步简化这一过程和/或在组织收集和均质过程中稳定RNA。这些产品中最广为人知的是TRIzol®(也称为TRI Reagent®，RNAzol®，QIAzol®，由许多不同的公司销售)。TRIzol®是一种一体化的酸-胍-苯酚溶液，将原无试剂盒协议的均质化溶液和苯酚添加到一个步骤中。在TRIzol®中均质后，离心去除不溶物，上清液用氯仿提取，如上述无试剂盒方法。

研究人员还开发了在细胞裂解前稳定组织内RNA的方法。这些产品，即Thermo的RNAlater®和Qiagen的RNAProtect®，是基于硫酸铵的溶液在细胞或组织中抑制RNase活性-它们实际上不会在化学上稳定RNA分子(Allewell和Sarma, 1974)。此外，ThermoFisher提供了一个关于如何将RNAlater®与TRIzol®结合使用的协议和硫酸铵稳定溶液可以自己生产。

无试剂盒RNA提取方法的一个常见问题是DNA的携带，这可能会使下游应用的结果复杂化，如定量PCR来评估基因表达。研究人员可以做几件事来解决这个问题。首先，注意你的提取——如果你需要真正干净的RNA，重要的是要确保提取时，只取水层，以避免从底层有机层携带DNA。另一个技巧是用氯化锂沉淀RNA。LiCl溶液选择性地沉淀RNA，而不是DNA和蛋白质。最后，在你的重悬RNA样本上使用脱氧核糖核酸酶(市场上有几种脱氧核糖核酸酶产品可供选择)将有助于确保DNA污染不会成为问题。