植物生物学中的RNA干扰:旧的最爱的新工具

这篇文章是由客座博主Robert Orr贡献的，他最近收到了P高清。伍斯特理工学院的生物学与生物技术。

RNAi是什么?

功能丧失(LOF)实验是我们理解复杂生物过程的基石。有许多工具在DNA、RNA或蛋白质水平上以直接或不偏不倚的方式扰乱生物功能。在生物学问题的背景下，“正确”选择工具需要仔细平衡任何技术的固有优势和局限性。例如，虽然基因敲除长期以来被认为是LOF研究的“金标准”，但植物中发现的高基因拷贝数使得传统的敲除从实际角度来看不具吸引力。因此，作用于DNA下游的技术，如RNA干扰，可以独立于基因拷贝数，可逆地发挥其作用。

RNA干扰(RNAi)是一种保守的真核生物过程，双链RNA (dsRNA)的大约20-30个核苷酸会导致任何包含dsRNA互补序列的基因的下调或“沉默”(Wilson和Doudna, 2013)。

RNAi由两种非专属的基因沉默途径组成:转录和转录后基因沉默(PTGS)。在这两种途径,短双链RNA片段(siRNAs)是由长dsRNA通过一个名为小礼帽的核糖核酸酶III酶(图1)。植物王国已经扩大了的帽子不同Dicer-like酶和酶是参与生物起源不同的小分子RNA(图1)。这些siRNAs可以发挥他们的基因沉默效应靶向mRNA降解、阻断翻译或染色质修饰互补基因序列(图1)。因此，外源应用长或短dsRNA很容易导致基因沉默。然而，需要注意的是，裸的和未修饰的双链rna会引起免疫原性反应，使RNAi的有效性和解释复杂化。幸运的是，研究缺乏这种先天免疫的植物和其他生物体的研究人员不必担心，他们已经从dsRNA应用的方便性中受益。

图1:一个rna诱导转基因的原理图。通常，期望的RNAi目标被表达为由一个环状区域分隔的反向重复序列，该环状区域有助于形成发夹RNA结构，从而导致内源性RNAi机制的处理。或者，内源性miRNA前体可以被设计成人工miRNA。经过处理的miRNA或sinas然后在转录或转录后沉默靶基因。在植物中，不同的dicer-like酶(DCL)将dsRNA加工成特定类型的干扰rna。

RNAi vs. CRISPR:互补技术

它可以说克里普尔特彻底改变了分子生物学，并以前所未有的方式实现了功能研究。随着CRISPR技术的迁移崛起和多样性，人们可能会对RNAi延伸到历史。RNAi的直接性是无与伦比的 - 与需要外源蛋白质的CRISPR实验不同，RNAi的成功诱导只需要DSRNA的存在。在植物中，CRISPR技术主要用于破坏DNA水平的功能，从而限制了高拷贝数和基因组基因座的效果，具有低可访问性。此外，基因敲除策略不能用于调查必要基因。

历史上，基因沉默方法被认为是普遍的脱靶效应。这一结论是基于大量表型差异之间的基因沉默和敲除方法相同的基因。然而，最近的研究对这种普遍的假设提出了质疑。具体而言，由于使用外显子跳过、替代起始密码子和/或转录适应现象，被认为是敲除的crispr生成的突变体可以维持部分功能(Smits et al.， 2019;Sztal和Stainier, 2020年)。此外，一项研究在高通量生存筛选的背景下直接比较了CRISPR和RNAi，发现两种技术的精确性相同，但每种方法恢复的是已知的生存能力所需的不同基因(Morgens et al.， 2016)。只有将两种方法生成的数据结合起来，才能形成更全面的基因列表，准确地反映出已知的对细胞生长至关重要的基因范围。总之，这项出色的工作强调了使用正交方法来确定感兴趣基因的功能的重要性。

RNAi的工具

可以说，RNAi最大的优势是技术的直接性——所有这些都需要与你的基因或感兴趣的基因互补的dsRNA来触发RNAi激活。

一个典型的RNAi实验可以分为三个基本步骤:

• RNAi触发器的创建
• 传递RNAi触发器
• 描述RNAi表型。

虽然所有这些步骤都是积极发展的领域，但第一步必然决定其后两步的方向和范围。因此，我将重点介绍rnai研究第一阶段的不同方法和考虑。

RNAi触发器的创建需要一些初始考虑，如起始材料(基于dna的载体或纯化RNA)和激活RNAi机制时dsRNA的初始状态(长dsRNA，通常是发夹RNA，或人工microRNA)。由于易于使用和能力产生长期RNAi表型，使用用于RNAi触发的DNA模板是最普遍的方法。

长发夹RNA

诱导RNAi最简单的方法是表达长发夹RNA (hpRNA)。这种方法是便利的DNA构建，使插入~ 400bp互补的基因目标作为反向重复(图1)利用这种技术，如果a采用一致性序列(目标间的一致性~90%)或多个目标序列串联。hpRNA在植物研究中得到了广泛的应用，在植物群落中有许多不同的结构。每个结构都有独特的特征，例如hpRNA的可诱导表达和/或将基因靶序列融合到荧光报告序列(下面讨论)。这些构造的示例包括PGAPI.，它允许简单地创建具有基于网关的克隆和培养的植物的基于网关的克隆和直接的阳性选择LIIbeta F - 1-2 RNAi，这使得内含子剪接的hpRNAs可以通过金门克隆进行组装。

人工微RNA和短发夹RNA

长hpRNA方法的最大限制被认为是脱靶效应和可变的沉默效率。为了解决这些缺点，短hpRNAs (shRNAs)和人工微rna (amiRNAs)都被频繁使用。尽管相似，amiRNAs是由基因组中发现的microRNAs的内源性前体设计的，而shRNAs是外源性的。重要的是，使用shRNA/amiRNA只产生一个~21 nt的干扰RNA，而不是由一个长hpRNA触发器产生的sirna组合。虽然SH-和Amirnas可能比长HPRNA更具特异性，但它们必须单独设计和经验评估它们的基因沉默功效，从而需要大量的投资。

一旦靶mRNA被裂解，被裂解的mRNA可以诱导进一步的RNAi。这个过程，被称为“及物性”，对任何关于特定RNAi技术特异性的声明提出了质疑。当传递性增强RNAi的效力时，它也可以增加脱靶效应的发生。然而，基于amiRNA的RNAi实验通常显示高度特异性和稳健的基因沉默(在初步优化amiRNA之后)。虽然下游工作是必需的，但可以在Addgene上找到几个载体，可以作为一个很好的开始(#22988，#137884)。这两种载体都允许分别基于水稻和拟南芥的miRNA前体创建amiRNAs。

短发夹RNA (Short hairpin RNA, shRNA)在概念上与上面提到的microRNA前体相似，是哺乳动物研究领域中一个流行的RNAi触发器。幸运的是,哺乳动物中shRNA的许多工具可在Addgene下载。

识别主动沉默的植物

一旦您将RNAi介绍到您的生物体中，您如何识别主动沉默的？在这里，我将介绍一些筛选方法来识别它们。

视觉筛选

无论你决定何种RNAi触发类型，任何RNAi实验都可以从一种简单的方法中获益，这种方法可以识别和量化主动沉默的植物。非破坏性方法，最常见的荧光报告者，直接耦合沉默你的基因目标沉默报告者。这是在DNA构建的水平上实现的，你的rna靶标以反向重复定向融合到包含针对荧光报告物的靶标序列的DNA主干上。因此，一个单一的发夹dsRNA被产生，它包含了与你感兴趣的基因和报告基因相对应的序列。这种方法极大地提高了实验的吞吐量，因为沉默的植物可以很容易地识别和有容易观察到的表型量化。基于荧光报告基因的RNAi结构已经被设计并广泛应用于植物中，例如模型开花植物拟南芥（Li等，2013;张等人，2018）和模型苔藓Physcomitrium(Physcomitrella)金属盘(Bezanilla等人，2005;Nakaoka等人，2012)。

一种新的基于正选择的RNAi方法

到目前为止，所有基于DNA的RNAi实验通常都参与抗生素选择以测试RNAi转基因的存在，然后是RNAi活性的荧光读数。作为植物研究员，传统的HPRNA和视觉筛选方法以两种实用方式受到限制：可变沉默效率和劳动密集型方法隔离RNAI植物。通过RNAi的视觉记者，可以容易地评分表型，例如形态学参数。然而，确定您的特定目标的转录物或蛋白质丰度所需的视觉鉴定的亚群的物理分离。对于传统细胞培养，通过荧光激活的细胞分选（FACS）可以容易地实现活性RNAi亚群。在有限的单细胞原生质体分析外，这是不可能的。相反，必须通过荧光报告器进行视觉鉴定微观植物通过荧光报告和手动提取。该过程是令人疑惑和耗时的，因为具有降低的生长表型的RNAi突变体需要额外的植物以具有足够的组织以进行下游表征。

为了同时解决传统RNAi方法的局限性，我和其他人在Luis Vidali实验室设计了一种新的RNAi方法。我们而不是使用荧光输出来监测RNAi，我们设计了一种阳性选择记者，从而存活本身是有效基因沉默的。我们通过创建直接将任何基因靶向序列与腺嘌呤磷基转移酶（APT）基因的靶向序列直接融合到靶向序列的构建体来实现这一点，这在许多生物中保守。当补充腺嘌呤类似物如2-氟纳米（2-FA）时，具有功能性APT的生物将转化为细胞毒性核苷酸，导致死亡。在2-Fa的存在下，存活需要APT的有效基因沉默。通过偶联APT的沉默和感兴趣的任何基因靶标，只有积极沉默于足够程度的生物才能保持活力。这可能降低RNAi输出的可变性并使下游表征进行了改性，因为可以收获整个培养而不是显微镜隔离。进行基于APT的RNAi实验所需的质粒是现在可以在Addgene上使用。这些包括结构，允许容易插入任何目标序列，以及必要的控制质粒。

非常感谢我们的客座博主Robert Orr!

罗伯特·奥尔(Robert Orr)最近在伍斯特理工学院(Worcester Polytechnic Institute)获得了生物学和生物技术博士学位，他在路易斯·维达利(Luis Vidali)的实验室研究了植物如何实现极化细胞生长。为了他的下一个冒险，他将加入苏黎世大学达伦·吉尔摩的实验室。他对生物是如何在细胞和多细胞尺度上精巧而有力地自我组织而着迷。

参考文献

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Smits AH, Ziebell F, Joberty G, Zinn N, Mueller WF, Clauder-Münster S, Eberhard D, Fälth Savitski M, Grandi P, Jakob P, Michon A-M, Sun H, Tessmer K, Bürckstümmer T, Bantscheff M, Steinmetz LM, Drewes G, Huber W(2019)生物可塑性拯救了CRISPR敲除中的靶活性。Nat方法16:1087-1093。https://doi.org/10.1038/s41592-019-0614-5

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张宁，张东，陈双林，龚伯强，郭勇，徐玲，张学宁，李建峰(2018)工程人工microrna的多基因沉默和简化转基因筛选。植物生理学杂志https://doi.org/10.1104/pp.18.00828

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