罗莎拉:用于学习自噬的荧光pH-生物传感器

由贝丝学会主席

罗萨斯是pH敏感的荧光生物传感器和Addgene一起储存的Mark Prescott博士。该系统用于监测和分析酵母细胞的细胞质和细胞器的自噬。自噬(希腊语为“自我进食”)是由于缺乏营养而引起的,以细胞质和细胞器为目标的液泡/溶酶体降解和再循环。罗塞拉自噬感知能力的关键在于,当它从一个更中性的pH区(如胞浆)到高pH的液泡时,它的荧光发射光谱发生变化。继续读下去,了解更多以前研究自噬的方法,以及罗塞拉是如何改进它们的。

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学习自噬的方法

生物化学测定

  • 长寿蛋白降解:该方法测量放射性标记的长寿命蛋白的降解率,作为自噬的代理。细胞用同位素标记的氨基酸培养数小时到数天,然后用未标记的氨基酸进行短时间的生长。这个洗脱期主要通过蛋白酶体降解去除放射性标记的短命蛋白。然后通过测量培养上清液中的放射性量(这是蛋白质降解的指示)来诱导和定量自噬。为了控制由于其他途径引起的蛋白质降解,标准做法是比较使用或不使用自噬抑制剂处理的样品的降解率。虽然这种方法确实提供了自噬的定量测量,但它只测量整体自噬(而不是提供关于哪些蛋白质或细胞器正在被降解的更细粒度的细节),而且速度很慢。

  • 碱性磷酸酶活性:在酵母中,PHO8基因编码真空碱性磷酸酶。一般PHO8在ER中合成,通过分泌途径递送到液泡,然后切割以产生活性形式的蛋白质。为了监测自噬,表达PHO8Δ60突变蛋白。除非诱导自噬,否则PHO8Δ60以非活性形式定位于胞嘧啶。然后胞嘧醇的非选择性显微镜导致液泡中pHO8Δ60的积聚,在那里它被切割以产生活性酶。PHO8磷酸酶活性或PHO8的分子量从未切割的裂解形式的偏移是该测定的最终读出。这也是自噬的定量测量,但与上面的蛋白质降解测定一样,它很慢,只测量散装自噬。

形态分析

  • 电子显微镜电子显微镜是研究自噬的传统方法。这种方法依赖于基于形态学的自噬结构的识别。自噬体相对容易识别:含有未消化的胞质内容物的双膜结构。与液泡或溶酶体融合的自噬小体更难识别,因为它们的内容物可能处于不同的降解阶段。此外,电子显微镜分析是耗时的。

  • GFP标记的ATG8P或LC3ATG8.是影响自噬的一组基因的一部分(阿格在酵母)。Atg8p(“p”代表蛋白质)与自吞噬体膜有关,因此用GFP标记它可以跟踪酵母中前自吞噬体结构、自吞噬体和自吞噬体的定位或积累。一个gfp标记的LC3版本,哺乳动物Atg8p同源物,也可以用来监测自噬,但在某些条件下,它以自噬独立的方式聚集。此外,追踪Atg8p或LC3并不能提供关于自噬小体内容的信息,也不能提供关于在液泡或溶酶体中被降解的内容的信息,因为一旦自噬小体与液泡或溶酶体融合,Atg8p和LC3都被降解或释放。

罗塞拉荧光性质

rosella biosensor(右边的图片)从澳大利亚鹦鹉上获得了它的名字(左边的图片)

Rosella是一个以鲜艳的澳大利亚鹦鹉排名的双色发射生物传感器。它由两种串联荧光蛋白组成:相对pH不敏感的RFP变体,DSvwin德赢娱乐平台RED.T3和pH敏感的GFP变体,超级Ecliptic氟胺(SEP)。它们通过9个氨基酸接头连接,该氨基酸连接物融合到DSRED.T3的C-末端。有关Rosella的激励和发射光谱的摘要,请参阅表1。DSRED是ROSELLELALA的永久荧光标签部分:它将发出红荧光,无论其在细胞中的定位如何。SEP的pH敏感性意味着Rosella将荧光绿色,除非它在像污垢或溶酶体这样的酸性环境中。有关基于其本地化的颜色荧光罗萨氏散发的摘要,请参阅表2。

表1:罗萨尔拉的激励和发射光谱概述。

成分 排放 pH范围
dsred.t3.

488,543 *,568 nm

587 nm.

~ 4.9 - 9

九月

488 * nm.

508 nm.

〜6.5 - 9

* Rosado等人确定的最佳顺序激发波长:有关pH对罗莎氏菌荧光特性的更多细节,请参见表2。

表2:本地化对罗氏荧光发射的影响。

本地化 pH值 发射颜色
cytosol.

~ 7.5

红色的绿色的
线粒体

~ 8

红色的绿色的

灰烬

〜6.2

红色的

溶酶体 ~ 4.8 红色的

用Rosella研究酵母的自噬

当没有信号序列和线粒体通过柠檬酸合酶的线粒体靶向序列表达时,rosella靶向细胞溶质。在正常生长条件下,两种变体被排除在液泡之外,并发出红色和绿色荧光。在4小时的氮饥饿后诱导自噬,红色但不是绿色荧光积聚在液泡中。有关细胞质线粒体rosella的荧光的示例,请参见图2。在这两种情况下,液泡中的红色荧光随着诱导的自噬诱导条件的较长而增加。

rosella在左侧和线粒体上的酵母细胞溶质表达

Rosella通过追踪被运送到酵母液泡(即细胞质,线粒体)的东西,而不是追踪一般的自噬标记物,使得研究自噬背后的机制变得更容易。这对于比较自体自噬和线粒体自噬,即线粒体的靶向自噬特别有用。所示Sargsyan等。这也可能使罗塞拉融合,从而监测你的蛋白质的自噬感兴趣。

你准备好试试罗塞拉了吗?这两个cytosol-targeted线粒体目标变种可从Addgene。


参考文献

1. Rosado,C.,Mijaljica,D.,Hatzinisiriou,I.,Prescott,M.,&Devenish,R. J.(2008)。罗萨尔拉:荧光pH-生物传感器,用于报告酵母中的细胞溶胶和细胞器的真空转换。自噬,4(2),205-213。DOI:10.4161 / auto.5331。PubMed.PMID:18094608

2.Sargsyan, A., Cai, J., Fandino, L. B., Labasky, M. E., Forostyan, T., colsimo, L. K., Graham, T. E.(2015)。使用单一荧光生物传感器快速平行测量哺乳动物细胞的自噬和线粒体自噬。科学报告,5(1) doi: 10.1038 / srep12397。PubMed.PMID: 26215030。pmed中央PMCID: PMC4517063

3. Mizushima,N.,Yoshimori,T.,&Levine,B.(2010)。哺乳动物自噬研究中的方法。细胞,140(3), 313 - 326。doi: 10.1016 / j.cell.2010.01.028。PubMed.PMID: 20144757。pmed中央PMCID: PMC2852113

4. Klionsky,D.J.,Cuervo,A. M.,&Seglen,P. O.(2007)。用于将酵母自噬的方法。自噬,3(3),181-206。DOI:10.4161 / auto.3678。PubMed.PMID:17224625

5.野田,T., & Klionsky, D. J.(2008)。第三章:定量分析Pho8Δ60非特异性自噬。自噬的酶学方法:低等真核生物和非哺乳动物系统,A部分,33-42。doi: 10.1016 / s0076 - 6879(08) 03203 - 5。PubMed.PMID:19185711.

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