这篇职位由撒母耳莫尔·莫尔森森是东北大学博士候选人贡献。
与工厂合作并不总是一个耗时的过程。虽然在组织培养中培育出转基因毛状根系需要半年时间，而培育出转基因植物则需要更长的时间，但一个短暂的植物叶片转化过程可以为植物生物学家节省一些时间……实际上是几个月。
在里面Lee-Parsons实验室我们正在研究癌症治疗药物长春碱和长春新碱的生产在药用植物中是如何调控的Catharanthus Roseus.（图1）。我们研究的最终目标是在植物或植物组织培养中增强其生产。
C. Roseus.模型生物体不是像拟南芥或烟草。研究基因功能C. Roseus.受到方法可用性的极大限制。感染根出杆菌根草杆菌可在组织培养中培养出稳定的毛状根系。这种方法常用于C. Roseus.但是，在毛状根中不能研究特定于光合活性组织的过程，因为根部缺少官能叶绿体和叶片特异性细胞类型。转基因毛状根的发展至少六个月。产生转基因植物需要更长时间，更劳动，效率更低，效率低，并且通常不会再现。在创建转基因培养物或植物之前，我们的瞬时表达方法使我们能够快速筛选和研究转录因子候选和基因在生物合成途径中的调控。
为什么植物科学家做瞬态叶片变换
转基因植物的发展是非模式生物普遍面临的问题。因此，瞬态法通常是研究基因功能的首选方法，因为这些实验可以在几天到几周内完成，而不是几个月到几年。在植物科学中，“瞬时转化”通常是指既不能从转化后的组织中再生出稳定的细胞系或植株。基因功能的研究通常是通过瞬时沉默和/或过表达植物感兴趣的基因。
沉默基因的常用方法
病毒诱导的基因沉默(VIGS)是一种瞬态技术，利用病毒和植物的转录后机制来沉默感兴趣的基因(Unver和Budak, 2009)。这个方法很管用C. Roseus.。
过表达基因的一种常见方法
在植物拟南芥和烟草,农杆菌属进入叶片的浸润是过表达基因的简单有效的方法，并评估其功能。在自然界农杆菌属含有含有T-DNA(转移dna)区域的质粒。在感染过程中，这个T-DNA区域被转移到植物中。在实验室中，我们可以利用这一自然过程，用我们感兴趣的基因或报告基因替换T-DNA区域上的基因，这样就可以跟踪转化和基因表达。在短暂的叶片转化过程中，工程农杆菌属菌株与叶片组织接触，带有感兴趣基因的T-DNA区域被转移到细胞中。但对于C。roseus也叫,农杆菌属渗入树叶的效果并不好,因为叶子有一种蜡质，很难渗透。
我们最近克服了这个问题C. Roseus.通过与幼苗一起工作，优化瞬变过程的其他几个方面(Mortensen等，2019)。我们的方法也可以为其他物种瞬态转化系统的发展提供一些有用的指导。
发展暂态叶变换方法时要考虑的事项农杆菌属:
如果您对该领域的新手，以下是第一个瞬态叶片转换的有用提示：
检查您的物种是否有工作协议
这将为您节省大量时间。不要重新发明轮子。
测试不同的叶子年龄
通常年轻的叶片工作得更好。不是每一片叶子都同样容易发生短暂的变化。
选择好的报告基因
有很多很棒报告基因你选择哪一个取决于你的实验(de rujter et al.， 2003)。例如，我们对GUS基因进行了初步转化，看看转化是否成功。一旦我们走上了正确的轨道，我们就转向了荧光素酶，以便更容易地量化不同治疗对转化成功的影响。下面是一些报告基因的例子。
- GUS基因(β-葡萄糖醛酸酶)和组织化学GUS染色是一个非常有用的可视化报告(图2)。GUS酶切割底物，然后形成蓝色沉淀。GUS通常是建立一个新的转化协议的首选，因为它可以很容易地显示哪些组织已经转化。但要注意:检查你的组织是否有类似于gus的活动。使用以下命令运行控件农杆菌属缺乏GUS基因，因为植物可以有内源性GUS-like活动(Hu等人，1990)。我们通常使用pSB161 - pL2_pSB90_2x35S::格斯::载确认转换成功。
- 荧光素酶是伟大的定量报告，并使用底物产生生物发光。例如，荧光素酶的mRNA和蛋白质半衰期通常比GUS短，因此是测量启动子活性的很好的时间报告因子。有用的阳性控制包括:pSB96 - pL2_pSB90_2x35S:: fLUC-I:: tno&pSB166 - pL2_pSB90_tMAS:: rLUC-I:: pma。
- vwin德赢娱乐平台荧光蛋白(FP，例如GFP)有多种用途。通常，FP与目标蛋白融合，以阐明目标蛋白的亚细胞定位。
测试不同的叶片渗透方法
- Co-cultivation(Li et al.， 2009):共同培养农杆菌属用你的叶子是一种非常简单的转化方法，但在许多物种中可能是低效的。注射器或真空渗透更有效。
- 注射器渗透(D'Aoust et al.， 2009):通常使用没有针头的注射器注射农杆菌属通过气孔培养到叶片的背面(下表面)。这是一种简单且易于实现的技术。不同的实验者成功与否可能有所不同。
- 真空渗透(Mortensen et al.， 2019):叶子或整株植物被放置在一个农杆菌属用真空钟或干燥器施加溶液和真空。通过沉没组织通常可以看到成功的渗透（参见图3）。此方法可能是最可扩展的方法。
把你的植物转移到黑暗中变身前16小时。
我们通常在转化前16小时将植物转移到黑暗中，然后在转化后再让它们在黑暗中待两天。
使用内含子
植物启动子可以被识别或渗漏农杆菌属。与报告基因特别有问题，因为您可能会观察到表达式农杆菌属而不是植物。例如，我们已经看到了强表达格斯含CaMV 35S启动子的基因农杆菌属。这可以很容易地通过使用内含子来避免，内含子可以从植物的转录本中移除，但不能从植物中移除农杆菌属。
测试不同农杆菌属菌株
我们使用了解除武装根癌土壤杆菌菌株GV3101(pMP90)对我们很有效。
使用一个良好的工作矢量系统
这允许您快速组装向量并测试不同的想法。我们是超级粉丝基于金门的MoClo系统。上面提到的该博客文章中提到的矢量可以使用载体，但是使用Moclo系统，您可以轻松快速地创建定制向量。有关植物Moclo的更多信息，请查看此项采访Nicola Patron，谁分享了MoClo植物试剂盒通过Addgene。
对我们来说，短暂的叶片转化对于筛选候选基因和加快研究速度有很大的帮助。当然，还有更多的瞬时叶变换，但我们希望这些技巧可以帮助您开始。一旦你在你的实验室建立了一个良好的工作协议，它可以成为你的研究的一个强有力的工具。请在下方评论添加更多的技巧和经验。
非常感谢我们来自东北大学的客座博主Samuel Mortensen。
塞缪尔·莫特森是位于波士顿的东北大学的博士生。他获得了莱布尼茨Universität汉诺威(德国)植物生物技术的理学士和理学硕士学位Lee-Parsons实验室。
参考
D'Aoust, Marc-André，等。用注射器农渗法在植物中瞬时表达抗体植物重组蛋白。人类出版社，2009. 41-50。PubMedPMID: 19183892。
De rujter, n.c.，等人。用于植物基因表达研究的GUS、LUC和GFP报告系统的评价和比较植物生物学5.02(2003): 103 - 115。
胡庆叶等。种子植物中固有的GUS-like活性植物细胞的报道9.1（1990）：1-5。PubMedPMID: 24226366。
Lee, Min Woo和Yinong Yang。"通过农业渗透叶片的瞬时表达试验"拟南芥的协议。人类出版社，2006. 225-229。PubMedPMID: 16739580。
李建峰，等。FAST技术:一种基于农杆菌的简化转化方法，用于拟南芥和其他植物幼苗的瞬时基因表达分析。工厂方法5.1(2009): 6。PubMedPMID: 19457242。公共医学中心PMCID：PMC2693113。
莫滕森，塞缪尔等人。EASI转化:一种分析Catharanthus roseus幼苗基因功能的高效瞬时表达方法植物科学前沿10（2019）。PubMedPMID: 31263474。公共医学中心PMCID：PMC6585625。
Unver, Turgay和Hikmet Budak。"病毒诱导基因沉默，一种转录后基因沉默的方法"国际植物基因组学杂志2009(2009)。PubMedPMID: 19547658。公共医学中心PMCID：PMC2699436.。
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