CRISPR基因分型测序选项

由Guest Blogger.

本文由剑桥大学生物化学博士研究生、客座博主Søren Hough撰写。

CRISPR实验过程中最重要的步骤之一是验证编辑。无论您使用哪种CRISPR基因组编辑系统,仍然有机会是观察到的表型是由偏离靶突变引起的,而不是靶基因中的编辑。

验证过程,也称为CRISPR基因分型,对演示基因型和测定表型之间的因果关系至关重要。验证这些连接可以帮助缓解再现性危机在生物学中。作为Crispr在生命科学中的生长和建立学术界,工业,尤其是诊所的标准化验证技术,这是解决这些问题的关键。

流行的验证方法是不够的

如讨论的那样CRISPR 101:验证您的Genome编辑,有各种各样的Crispr基因分型选项。最常见的选项包括不匹配的切割测定,例如测量仪™,T7E1和Sanger测序。然而,最近的研究表明,Surveyor™和Sanger都可能不是用于验证编辑的充分标准。

不匹配的裂解测定依赖于宿主DNA的编辑链和野生型链之间的配对。当这些链杂交时,核酸酶可以检测用不匹配的股线并切割它们。然后使用凝胶电泳可视化结果。

由于它们的相对简单和成本低,Survestor™和T7E1已被广泛采用。这些测定的问题是它们不提供序列级数据。它们也有〜5%的检测限。这意味着它们不会可靠地检测在较少5%的人口中发生的编辑事件(Fu等人。2013年vouillot等人。2015年).

同时,Sanger测序是费力的,耗时的耗时,不能应用于异因群体(贝尔等人。2014年).此外,Sanger测序的检测限度为50-20%(尽管在某些研究中已得到改善)(戴维森等人。2012年Tsiatis等人,2010).随着该领域向验证CRISPR实验的标准化门槛迈进,许多人开始转向下一代测序选择,而不是旧的方法。

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有偏见的测序方法

有两种初级的偏移检测方法:偏见和无偏。偏置技术仅序列在预测的基因组中的某些位点含有偏离目标切割事件。无偏见的技术,无论如何都针对整个基因组搜索偏离目标网站在Silico.预言。

这些技术以重要的方式不同,但也可以通过提供关于基因组测序的广泛和具体细节来互相补充。在音乐会中使用,这些方法可以为研究人员提供合理的水平,肯定是他们所看到的效果不是由于偏离目标。这是提高研究结果的信心和再现性的宝贵措施。

表1:偏倚基因分型选择

技术 序列信息 检出限 优势 缺点
不匹配裂解测定 不提供 5% 便宜,简单 低吞吐量、低灵敏度
Sanger测序 假如 20%(变量) 序列级数据 低吞吐量,不适合异因人口,敏感性低
有针对性的扩增子测序 假如 0.01%(变量) 序列级数据,非常敏感 不要排序所有DSB,可能会错过未预测的脱机休息

预测算法:可以从一个很好的地方开始进行偏置验证

眼下,许多软件工具使用计算方法预测SGRNA的脱靶效果。它们在基因组上识别可能的偏移网站,并根据基因组和SGRNA的序列确定错配的位置。对于大多数研究人员来说,这是一个很好的起点,因为它提供了一个推定的脱离目标网站列表,他们可以稍后序列序列进行突变。

研究人员可以用于测试在CRISPR实验后测试预测的偏离目标站点的方法是有针对性的扩增子测序。来自目标扩增子测序的信息高度敏感,检测水平低至0.01%(Hendel等人。2015年).低检测率意味着如果使用这些技术保持未检测到,调查仪可能相对确定它们的样品没有偏离目标突变。

偏离目标突变的频率是寻求明确链接基因型和表型的研究人员的必要数据点。作为翻译研究人员开始使用CRISPR作为治疗,履行这些验证也是关键。低频偏移目标效果可能会在研究环境中产生IRREProocue数据,但这些事件可能在诊所具有灾难性的健康效果。基于NGS的方法提供了有关推定的脱离目标站点的最完整的信息配置文件,包括编辑率和修复产品序列。

有针对性的扩增子测序并不讲究整个故事

无偏的测序方法尽管脱靶预测算法已经取得了进展,但他们的全基因组搜索标准并不是详尽的。错配公差设置通常局限于< 4bp的脱靶位点。由于在末端3 ' PAM位点有更严格的序列要求,脱靶列表通常也由gRNA长度上的错配位置加权(Fu等人。2013年;Pattanayak等人。2013年).

这种方法遗漏较大的不匹配(例如六个核苷酸),其可能仍然导致偏离目标双链断裂(Tsai等人。2015年).另外,目前的算法不考虑其他元素,包括与DNA结构(例如表观遗传修饰,凸起)有关的那些,这也可能影响偏离目标编辑。结果,仅通过传统算法预测的排序位点可能无法提供CRISPR编辑在模型细胞系或生物中的影响的完整图像。

存在几个选项,用于非偏见的偏离目标检测,包括DigeNome-SEQ(Kim等人。2015年) 为了体外分析,IDLV体内检测(Gabriel等人。2011年Wang等,2015Osborn等,2016)及HTGTS (Frock等人。2015年)对于基于细胞的实验。这些策略可以与音乐会一起使用在Silico.预测,以创建更全面的脱靶编辑事件列表。最常见的两种基于细胞的方法是全基因组、无偏性双链断裂鉴定(DSBs),通过测序(guideseq) (Tsai等人。2015年)直接原位打破链霉亲和素的标记、富集和下一代测序(BLESS) (Crosetto等。2013年).

GUIDE-seq和BLESS检测双链断裂,不需要高测序读取计数,这使得它们在许多实验室的多路测序中快速可行。然而,无偏检测并不像靶向扩增子测序那样敏感。例如,GUIDE-seq的最低检测极限似乎是0.1% (Tsai等人。2015年).这种对比频率为0.01%的扩增子测序(Hendel等人。2015年),随着CRISPR实验更接近临床(Tsai和Joung 2016).

表2:无偏析的基因分型选项

技术 检出限 应用程序 优势 缺点
GUIDE-Seq 0.1% 基于单元的 搜索所有DSB的基因组,不需要高读数,快速复用 需要交付DSODN(潜在有毒)
Digenome SEQ. 0.1% (游离体外) 在所有细胞类型上工作 必须以基于细胞的方法验证
IDLV 1% 基于单元的 可编程,可检测活细胞中的dsb 不像其他无偏见的方法,高背景
祝福 没有报道 基于细胞的(体外) 可用于整个动物模型的组织,不需要外源性成分(例如dsODN),不需要高读取计数(快速多路复用) 从细胞固定以来,需要大的细胞群,同比时间
HTGTS. 没有报道 基于单元的 识别易位 受染色质配置的限制,产生许多错误的底片

结合测序技术可以保证实验的有效性

无偏差的检测方法对于发现整个基因组中DSBs的证据是极好的。然而,他们降低的敏感性意味着最好的选择可能是将有偏见和无偏见的方法结合起来。正如Tycko等人。,2016年,无偏见排序和在Silico.预测应给出基因组中所有可能的编辑事件的广泛图像;从那里,扩增子测序可以以高精度的方式评估和验证偏离目标站点。

每个CRISPR实验都可能不需要使用这两种方法。由于> 3 BP不匹配或序列无偏见的偏离目标事件,但仅使用基因组无偏见的方法可检测。然而,大多数研究人员使用单个细胞克隆体外CRISPR实验。从池导出的单个单元克隆的可能性包含罕见的偏离目标事件和所需的编辑。Therefore, unbiased sequencing may not be worth the cost and labor when single clones are selected.相反,翻译研究可能需要两种形式的偏离目标分析的严格,以满足临床批准。

保持一致的一组标准作为现场寻求生成可重复,质量数据的关键,就生物系统中的遗传网络的作用。由于CRISPR不仅用于研究疾病,而且还用于治疗患者,NGS也将显着发挥临床治疗发展领域。有关更多信息和上述测序技术的详细概述,请参阅“优化CRISPR-CAS9基因组编辑特异性的方法”Tycko等人。2016年“定义和改善CRISPR-CAS9核酸酶的基因组特异性”Tsai和Joung 2016


非常感谢我们的访客博主Søren脚腕。我们还要感谢Monica Sentmanat、Victor Dillard和Ayokunmi Ajetunmobi对这项工作的贡献。

霍恩·斯伦·赫德森2019年索伦·霍夫是剑桥大学古尔登研究所史蒂夫·杰克逊教授实验室的生物化学博士候选人。在实验室之外,他是一名自由记者和科学作家,专注于如何用科学来创造一个更公正和公平的社会。阅读更多https://magazine。scienceforthepeople.org/

参考

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