PCR的网站定向诱变

由Guest Blogger.

网站定向诱变图形摘要这篇帖子由康奈尔大学的克里斯蒂安拉抱来博士博格尔贡献。

网站定向诱变是一种高度通用的技术,可用于以量身定制的方式引入特定的核苷酸取代(或缺失)。该方法可用于常规克隆(为了引入或移除限制性位点),在调节元件的映射中(对报告构建体中的突变启动子/增强剂),在蛋白质的功能分析中(用于进行丙氨酸扫描诱变或靶向替代的关键残留物),并在SNP分析中(至在质粒上下文中自然地引入SNP)。该技术在这个时代也是高度相关的克里普尔克;定向诱变通常适用于质粒,但也可以促进基因组编辑。通过CRISPR / CAS9诱导双链断裂的同源导向的修复(HDR)通常将定制的突变引入内核DNA。该站点定向的基因组编辑需要对内源目标的高同源性模板,但是为了方便修复,模板应该抵抗Cas9裂解。如果质粒含有模板,则可用于突变定向诱变突变PAM序列(对于CAS9切割至关重要),从而使所得构成对Cas9诱导的裂解抗性。

网站定向诱变摘要

简而言之,可以使用引物(具有所需的突变)在扩增整个质粒模板的PCR方案中引入质粒。使用a删除父模板甲基化依赖性内切核酸酶(即DPNI),并且细菌用耐核酸易骨折的质粒(PCR产物)转化。质粒与所得菌落中分离,并筛选所需的修饰。最后,测序阳性克隆以确认所需的修改和避免附加修改。

网站定向诱变摘要


实验指南

底漆设计

作为拇指的规则,所需突变两侧的11bp互补序列(通常为1-3个错配碱)足以在PCR反应过程中成功地退火到感兴趣的质粒上。理想情况下,您的引物应该没有回文和重复序列,而是如果存在,则次要的延伸通常可以确保3'-底座不形成二级结构。限制性位点通过诱变的引入(或消融)大大促促进了随后筛选成功突变的克隆的过程。向前和反向引物设计为互补,但只要保持至少6bp的重叠,每个引物可以延伸超过互补区域。该重叠确保PCR产生切口圆而不是线性产品(见图)。

模板

高纯度质粒预备显着提高了位点定向诱变的成功率。此外,您可能想要尝试不同浓度的模板(例如0.1-1.0 ng /μl)。较小的质粒(〜3kb)通常比较大的构建体更有效地扩增,但是通过简单地遵循聚合酶制造商PCR方案,可以公平地扩增大约6kb的质粒。请务必调整扩展时间以匹配模板的大小。通过将DMSO加入PCR反应(通常在3%终浓度约为3%)中,促进GC的质粒的扩增。DMSO减少了DNA模板的二次结构,也可以降低引物的退火温度。因为您将使用依赖于甲基化酶(DPNI)来消除来自PCR产物的母体质粒,因此质粒模板应与甲基化态化的细菌菌株(例如DH5α是坝+)分离。甲基化缺乏的细菌菌株可以通过达米13( - )突变鉴定 - 在制备位点定向诱变的质粒模板时,您需要透露这些菌株。

聚合酶

为了确保通过PCR工艺不引入不希望的突变,您需要高保真聚合酶。市场上有许多高保低的聚合酶;您需要一个有5' - > 3'聚合酶活性(用于扩增),3' - > 5'外切核酸酶活性(增加放大保真度),没有5' - > 3'外切核酸酶活性(可能会截断模板)。重要的是,您还需要一种DNA聚合酶,其产生钝端的PCR产物(例如PHUSE,PFU和排气聚合酶)。注意,某些聚合酶如TAQ产生A悬垂(在TA克隆中使用的特征)。在3'-末端干扰质粒重构的这种非互补碱,因此Taq聚合酶不能用于现场定向诱变。

核酸酶

除去模板DNA(未改性质粒)使用具有DPNI的限制性消化。DPNI是独一无二的,因为它只切割在GATC识别位点的腺苷甲基化的DNA。

转型:PCR反应后,不需要结扎以来大肠杆菌您将PCR产品转化为有效地修补DNA。这阻力标记来自父母的质粒提供了选择用于诱变诱变质粒的转化体的平均值。注意,任何残留的亲本质粒(通常来自不完全DPNI消化)也可以在这些条件下形成菌落。

筛选

如果引入限制性位点(或消融),可以通过鉴定具有片段长度多态性(RFLP)分析的该特定部位的存在(或不存在)来筛选细菌菌落。在该过程中,如果您的突变将另外的限制性位点引入质粒,那么,当用适当的限制酶消化质粒并在凝胶上运行时,存在于未修饰质粒的消化产物中存在的带子之一将分开进入两个较小的频段(图B,摘要a)。相反,如果您的突变烧蚀限制性位点,则用适当的酶消化将合并在未改性质粒的摘要中可见的两个较小的条带进入较大的带(未示出)。作为一个脚注;类似的方法可用于识别Cas9 / Crispr-诱导的基因组修饰

偶尔,PCR引物的多聚化可能导致所得质粒中的引物序列的重复。将近距离目标站点近端的短区域(<400bp)的附加限制摘要可以识别这些重复(相对于原始模板略大的频带尺寸)。由于尺寸差异,碎片应在高百分比琼脂糖凝胶上分离(〜3%)。请注意,引物复制将仅仅因为引入的限制站点也复制了初始RFLP分析中的检测。

验证诱变质粒

一旦鉴定了含有所需修饰的构建体(并确认不含底漆重复),最终验证是通过的测序包括插入物的质粒的功能区域。这是必要的,因为突变可能引入质粒(尽管处于极低的频率)中,这些突变可能干扰所得构建体的功能。在功能上重要区域跨越几kB的情况下(或富含GC和因此难以序列),随后可能更容易克隆将较小的区域(含有特异性修饰)进入亲本质粒(或其他)。这在具有多个功能区的大质粒的情况下特别相关用作诱变反应的模板。

网站定向诱变的替代方法

点诱变是相当容易的,但如果您想在大型结构中引入点突变,PCR引入的突变的风险可以更有利。特别是,如果一对独特的限制性位点位于靶位点附近,则可以用产生线性产物的引物对简单地扩增和突变该细粒的较小部分。然后可以使用独特的限制性位点将突变的产物克隆回原始质粒。或者,如果您想使蛋白质不起作用,您可以简单地引入帧移位突变。这可以使用限制酶来实现,该限制酶识别编码区域中的独特位点(优选地在5'端附近)并且也产生4bp突出。然后,您可以使用DNA聚合酶I的Klenow片段从这些悬垂的突出端产生钝端,并在标准连接反应中连接它们在一起,导致框架移位的编码区域。值得注意的是,与这些替代方案不同,PCR的网站定向诱变不依赖于独特点的接近度,并允许引入专门设计的突变(不限于帧移位突变)。因此,网站定向诱变是对质粒模板引入微小修饰的最流行的方法之一。

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非常感谢我们的客人博客克里斯蒂安·拉抱!

克里斯蒂安拉抱

Kristian Laursen是康奈尔大学的研究员。

参考

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