这篇文章由客座博主贡献James D. Fessenden是布莱根妇女医院的助理教授。

生物化学家经常挣扎，了解利益蛋白质的表现如何。它有多大？当您喂食它或添加必要的辅助因子时，它的哪些部分移动了？它有多少绑定合作伙伴，它们如何在蜂窝环境中脱离？如果这些是在实验室中按下问题，那么FRET实验是一种可行的生物物理学方法。

什么是FRET ?它有什么好处?

荧光共振能量转移(FRET)是两个荧光团之间的生物物理相互作用。当第一个荧光团(the捐赠者)被激发时，它可以通过共振直接将能量转移到第二个荧光团(the受体)，如果两个探针距离很近(通常30-100 Å，取决于探针)。事实上，FRET可用于计算供体/受体荧光团之间的精确物理距离(Stryer，1978年)，这种测量不受蛋白质、脂质双层、细胞器或其他细胞障碍的影响。

FRET已被用于许多应用中，包括Big Pharma（即HTRF和Lanthascreen）的药物发现（Degorce等人，2009)，测量细胞内钙含量(Miyawaki, Griesbeck, Heim， & Tsien, 1999)，监测激酶活性(Ni, Titov， & Zhang, 2006)，量化抗体/抗原的相互作用(Saraheimo等，2013年)，以及蛋白质翻译过程中核糖体结构变化的可视化(Ermolenko等人，2007)。所需要的只是蛋白质/核酸/脂质的兴趣荧光团标记当这些荧光团彼此靠近时，会发生FRET。

如何用FRET荧光团标记感兴趣的生物分子?什么时候需要绝对标记特异性，什么时候不需要?需要什么适当的控制来测试你的FRET试验，以确保它是有效的?本文讨论了这些问题，这些问题对于建立基于freet的分析或筛选是至关重要的(Addgene博客有一个极好的vwin.com mobile幻灯上的底漆以及如何衡量它）。

分子邮箱:如何把荧光团送到正确的地方?

FRET实验要求将供体和受体荧光团定位到你想要测试的不同生物分子上以进行相互作用。事实上，将荧光荧光团定位于生物分子有点像联邦快递。你的荧光团包裹需要去正确的城市(蛋白质)的正确邮箱(即结合位点)。在细胞中，这项任务更加困难，因为成千上万的生物分子每一个都包含多个结合裂缝，可以非特异性地吸收你的荧光团包。

FRET实验设计的一个重要概念是供体和受体对荧光团的靶向特异性要求不同。捐赠者必须被送到一个确切的地点(在你的分子城市的一个特定的房子的单一邮箱)。然而，受体并不需要和供体去相同的位置。只要一些受体分子被定位在附近(比如与供体位于同一条街上的邻近房子)，那么FRET测量就可以实现。事实上，即使大多数FRET受体被送到不同城市的错误地址，你仍然可以开发出一种成功的基于FRET的分析方法，因为能量转移只有在供体和受体靠近时才会发生。远离供体的受体>100 Å的结合不会导致能量转移，因此，你特定的FRET信号不会受到影响

由于施主和受体荧光团的目标特异性的这些根本差异，最好在谈论可用的工具时单独考虑这些案例。让我们首先考虑捐赠者，其中标签特异性最重要。

供体标记和特异性的需要

供体荧光团需要到达正确的位置。目标错误的捐赠者从来没有“看到”过FRET接受者，因此从来没有经历过FRET。如果这种非特异性标记远远超过合适的供体/受体对，那么任何可测量的FRET都会被大量未配对的供体所淹没。

将荧光供体定位到蛋白质上的最佳方法是将分子直接连接到蛋白质的肽序列中。因此，所有合成的靶蛋白分子都包含供体，更重要的是，不存在非特异性供体标记导致的荧光背景。

vwin德赢娱乐平台(FPs)是基因编码FRET供体的黄金标准(图1)。FP变量的得分，从而为FRET实验提供了一个宽广的供体荧光波长。但是，请记住，如果你进行FP融合，你将插入大约20- 25kda的蛋白质质量到你的蛋白质中，因此，由于这个庞大的插入，结构变化是不可避免的。大多数用于FRET研究的FP融合都位于目标蛋白的N-或c -末端，但即使是这些修饰也会影响某些蛋白质的结构或功能。

你可以使用tRNA抑制技术巧妙地对其进行位点特异性标记，而不是将庞大的FP插入蛋白质中(图1)(Dumas, Lercher, Spicer， & Davis, 2015年)。通过使用一种新的氨基酰tRNA合成酶/tRNA对，研究人员可以引诱核糖体在设计的终止密码子(通常是琥珀色，即UAG)插入一个荧光标记的氨基酸到期望的位点。在转译过程中，新的tRNA/非天然氨基酸在核糖体中发现UAG密码子，导致附着的荧光团位点特异性结合。然而，由于tRNA抑制在终止密码子上与自然链终止竞争，这些标记蛋白的表达水平通常很低。此外，需要对细胞的天然tRNA合成酶进行重大检查，到目前为止，这种方法仅在少数细胞类型(大肠杆菌和非洲爪蟾蜍卵母细胞,主要是)。然而，tRNA抑制质粒可以从已经掌握这项技术的沉积实验室获得，因此值得一试，特别是由于潜在的回报可能是巨大的:

质粒	TRNA合成酶	表达式主机
pMAH-POLY	Polyspecific氨酰合成酶	哺乳动物细胞
pDULE-ABK	pyrrolysyl-tRNA合成酶的脂肪族二氮杂胺氨基酸	大肠杆菌和哺乳动物细胞
pEVOL-pAzF	为p-azido-l-phenylalanine合成酶	大肠杆菌
Pevol-PBPF.	为p-benzoyl-l-phenylalanine合成酶	大肠杆菌
pAcBac1.tR4-MbPyl	pyrrolysyl-tRNA合成酶	哺乳动物细胞
pCMV-DnpK	dinitrophenyl半抗原	哺乳动物细胞
跳跃	AnapRS	哺乳动物细胞

请注意这不是一个广泛的列表

给接受者贴上标签:有时候犯错是可以接受的

与FRET供体相比，绝对的FRET受体标记特异性对于FRET实验的成功并不总是必要的。如果受体荧光团到达离供体很近的分子邮箱，只要不在供体的FRET范围内(如>100 Å)，就不存在错误地传递到细胞内其他位置的问题。研究人员开发了一种广泛的化学标记策略，适用于将FRET受体定位于蛋白质(综述见[Yan & Bruchez, 2015年])。为了让你开始，两种稳健的正交标记策略(图1)可以使用Addgene质粒进行。

他标签标签试剂

你可能已经在你感兴趣的蛋白质上有一个FRET受体结合位点:只是你还不知道而已!当与Cy染料-氮基三乙酸(NTA)缀合物(Kapanidis, Ebright， & Ebright, 2001)。这些Cy/NTA偶联物的工作方式与用于蛋白质纯化的NTA-琼脂糖珠相同:NTA与蛋白质上的His标签结合，偶联的Cy荧光团作为FRET受体。通过将两个NTA分子偶联到每个Cy染料上，以及将组氨酸标记的长度从6个残基延长到10个残基，可以增强结合亲合力。虽然这些Cy/NTA缀合物尚未上市，但它们很容易用荧光标记抗体的试剂合成，并且使用薄层色谱法(Fessenden，2009年)。然而，这些试剂可以非特异性地结合细胞内大量内源性生物分子，且不能跨膜，所以它们最好与质膜蛋白(如GPCRs、离子通道或细胞表面受体)或实验permeabilized细胞。

Biarsenical标记试剂

如果你想用FRET受体共价标记细胞内蛋白质，那么双砷是一个很好的选择。最初由钱永健及其同事(格里芬、亚当斯和钱，1998年)，这些染料是现在商用的Lumio Green.和Lumio红来自Invitrogen公司(现在更名为ThermoFisher Scientific)。这些试剂在结合一个6-残基四半胱氨酸标记(序列:CCPGCC)之前是不荧光的，该标记可以插入到目标蛋白中。这些试剂的作用是，结合是共价的，所以自由染料可以被洗掉。此外,标签对比可以改善使用含二硫化合物，如英国抗刘易斯(这最初是为了治疗重金属中毒在化学战中(Vilensky & Redman, 2003年]）。最重要的是，这些化合物交叉细胞膜，从而能够测量尺寸在完整的细胞。的毕业生实验室已经存一个网关向量Addgene,在哪里你可以插入你想要的蛋白质，得到一个c端融合的一个tetracysteine标签。此外,年代由于这些标签非常小，人们可以把它们插入到目标蛋白质的任何想要的位置，尽管预测的非结构环是最好的，因为这些标签形成-发夹(Madani等人，2009)。

供者和接受者:把它们放在一起

FRET的捐助者和接受者描述 以上可成对搭配 测量范围很广 分子距离 (见下表)。 然而，需要适当的对照实验来确定你的测定的动态范围。 这些实验 包括 产生阳性对照 构造捐赠人及的受体荧光团 结合位点是彼此相邻同样的蛋白质和一个消极的控制实验进行捐赠,只要与你的FRET受体一起培养的标记蛋白。这些实验将 定义 最大和最小的能量传递值 预计 , 从而 建立 的FRET测定的动态范围（图2）。

这些标记方法可以自由互换，FRET的新用途也在不断开发，所以不要害怕尝试新颖的、未发表的标签策略组合。FRET实验设计具有创造性和创新性，有价值的任何NIH资助申请的商品!使用烦恼,你五月获得对蛋白质结构的新理解可以带来对其生物学的新见解和它的行为。在FRET实验中可以使用的供体和受体对见下表。

捐赠	受体	标签	R0(一)一个	范围(一个)b	应用程序
CFP	Lumio Green.	Tc: CCPGCC	50	40 - 72	完整的细胞
	Cy3NTAc	保利他	44	35 - 63	质膜蛋白，透性细胞
	Cy5NTAc		32	25-45
GFP(类似荧光素)	Lumio红	Tc: CCPGCC	48	38 - 70	完整的细胞
	Cy3NTAc	保利他	63	50 - 90	质膜蛋白，透性细胞
	Cy5NTAc		43	34-62
YFP	Lumio红	Tc: CCPGCC	54	42 - 78	完整的细胞
	Cy3NTAc	保利他	65	52-94	质膜蛋白，透性细胞
	Cy5NTAc		59	47 - 85

^一个R₀是施主/接受者（D / A）距离，50％的距离发生。

^b范围对应于观测到的FRET效率在80%到10%之间的D/A距离。

^CCy3NTA和Cy5NTA以相似的方式绑定His标签，但使用不同的R₀值，从而实现校准的FRET距离测量(例如，参见Mahalingam等人，2014)。

James D. Fessenden目前是麻州波士顿布里格姆妇女医院麻醉研究部的助理教授。他的兴趣包括开发新的荧光标记试剂和结构表征涉及骨骼肌收缩的大离子通道。

参考

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