Split-BioID:一种研究蛋白质相互作用的改进方法

由Beth Kenkel.

定义蛋白质目的的一种方法是通过蛋白质间的相互作用(PPIs)。这些相互作用通常被建模为二元关系,即蛋白质A与蛋白质B相互作用;但是蛋白质是社会生物分子。它们可以是具有不同功能的多个动态重叠综合体的一部分。许多现有的鉴定PPIs的方法,如亲和纯化质谱(AP-MS),缺乏特异性鉴定与特定蛋白复合物相互作用的蛋白质的能力,而不是单个蛋白。的白求恩实验室通过创造克服了这个限制吗Split-BioID,这是一种距离依赖的生物素化技术的时空可控版本BioID。Split-BioID的关键优势是它允许验证二进制PPI以及识别其他相互作用的因素。

现有研究蛋白质相互作用方法存在的问题

  • 难以检测微弱和/或短暂的PPIs。许多PPI鉴定技术依赖于蛋白质相互作用体在整个下拉步骤中与诱饵蛋白保持密切接触,如AP-MS。这一要求常常阻碍弱和/或瞬时相互作用蛋白的识别。

  • 没有时空的控制。许多PPI检测方法缺乏时空控制或“开/关开关”。这使得他们伟大的工具提供一个全球性的概述与诱饵蛋白潜在的扶少团团员,但另一面是很难知道哪些蛋白质与诱饵在一个特定的时间点,即当诱饵与特定的蛋白质交互合作伙伴或当诱饵是一个特定的蛋白质复合体的一部分。

  • 不在本机单元上下文中执行。对于AP-MS,在诱饵蛋白被拉下之前,细胞被裂解,通常是用抗体。这可以人为地选择对抗在原生细胞环境之外不稳定的PPIs。

分裂生物方法

输入Split-BioID,一个时空可控的BioID协议版本。BioID和Split-BioID的关键组件是BirA*, BirA的混杂版本大肠杆菌生物素连接酶。在BioID中,BirA*与诱饵蛋白融合,并对诱饵半径~10 nm范围内的蛋白质进行生物素化。在split - bioid中,BirA*首先被分成两个非功能片段。当这两个片段靠近时,它们结合力量形成了一个功能性的BirA*酶。这种实验被称为蛋白质片段互补分析(PCA)。

在Split-BioID方法中,每个BirA*片段然后与已知相互作用的两个诱饵蛋白中的一个融合。当这种相互作用发生时,BirA*的活性被恢复,附近的蛋白质被生物素标记。为了进行标记,BirA*融合蛋白通过质粒或稳定细胞系在细胞中表达,然后这些细胞在含有生物素的培养基中生长。

烦恼是可用于研究二元蛋白质相互作用的蛋白质碎片互补测定的另一个例子。然而,FRET通常仅告诉您两种蛋白质交互,不能用于识别除了您已经荧光的互动伙伴以外的互动伙伴。

识别蛋白质与分裂生物id的相互作用

图1:使用分裂生物体鉴定蛋白质蛋白质相互作用。split - bioid是一种蛋白质互补试验,其中BirA*,大肠杆菌生物素连接酶分裂成两个非功能片段:n端BirA* (N-BirA*)和c端BirA* (C-BirA*)。这两个片段融合到两个蛋白质上,这里是蛋白质Y和蛋白质Z,已知它们相互作用。当蛋白质Y和Z相互作用时,两个BirA*片段相互补充,形成一个功能性的BirA*酶。当这种相互作用发生时,BirA*的活性被恢复,附近的蛋白质被生物素标记。当蛋白质Y和Z分离时,BirA*生物素化活性停止。

在BioID或Split-BioID中对蛋白质进行生物素标记后,细胞被裂解,提取蛋白质,并通过链霉亲和素下拉纯化标记的蛋白质相互作用体。胰蛋白酶消化后,通过质谱分析确定PPIs。如果使用Split-BioID-GFP和BioID对6个不相关的蛋白质进行富集,生物素化蛋白被认为是可能的相互作用伙伴。

Split-BioID的一个警告是BirA*融合的方向很重要!Schopp等人发现不同水平的融合蛋白表达和生物素化取决于标记的诱饵蛋白的哪个末端,以及BirA*的哪个片段,N-或c -末端,标记的诱饵蛋白。最好的方法是测试所有的组合,并选择通过Western blot检测得到最强生物素化信号的条件,从而使融合蛋白得到适当的定位。

Split-BioID的优点

与其他PPI方法(包括BioID)相比,Split-BioID的关键优势在于其对相互作用蛋白的时空控制标记;当两个诱饵蛋白相互作用时,附近的蛋白质被生物素化,但当这两个诱饵蛋白停止相互作用时,标记就停止了。这一特性对于深入表征动态蛋白质复合物特别有用。

如BioID的分裂生物体也可用于鉴定弱和/或瞬时蛋白质 - 蛋白质相互作用,因为即使与Bira *熔诱饵蛋白的相互作用停止停止。最后,分裂 - 生物和生物蛋白鉴定蛋白质,其在天然细胞接触中与诱饵相互作用。其他PPI方法可能需要蛋白质相互作用,以在细胞裂解和裂解物分级期间保持稳定(或待稳定)。

Split-BioID的重要注意事项

重要的是要记住,使用Split-BioID和BioID,任何在诱饵蛋白~10nm附近的蛋白质都将被生物素化。这使得我们无法区分与诱饵直接相互作用的蛋白质与那些间接相互作用的蛋白质或仅仅在诱饵蛋白质附近的蛋白质。SplitBioID提供了一个候选蛋白质列表,这些蛋白质是诱饵蛋白质相互作用组的一部分,而不是精确定位特定的蛋白质-蛋白质相互作用。对这些候选者的进一步描述对于理解它们如何与诱饵蛋白相互作用至关重要。

Split-BioID的另一个潜在限制是它的标记速度。生物识别需要6-24小时四环素诱导表达BirA*融合蛋白和生物素化信号的饱和。对于Split-BioID, Schopp等人允许在24小时内进行四环素诱导的表达和相互作用蛋白的生物素化。这种延长的潜伏期可能使检测半衰期短的蛋白质变得困难。

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参考

Schopp, i.m., Ramirez, c.c., Debeljak, J., Kreibich, E., Skribbe, M., Wild, K., & Béthune, J.(2017)。Split-BioID是一种条件蛋白质组学方法,用于监测时空定义的蛋白质复合物的组成。自然通讯。PubMedPMID:28585547。公共医学中心PMCID:5467174

Munter, S.D., Görnemann, J., Derua, R., Lesage, B., Qian, J., Heroes, E., Waelkens, E., Eynde, A.V., Beullens, M., & Bollen, M.(2017)。Split-BioID:用于二聚化依赖的蛋白质相互作用的接近生物素化分析。联邦快递信件,591, 415 - 424。PubMedPMID:28032891

伯克,B。,金正日,组长面粉糊,K.J, m &瑞达(2012)。一种混杂的生物素连接酶融合蛋白识别哺乳动物细胞中近端和相互作用的蛋白质。细胞生物学杂志。PubMedPMID:22412018公共医学中心PMCID:3308701

Macneill, S., & Varnaitė, R.(2016)。认识邻居:通过接近依赖的生物id标记来定位局部蛋白相互作用组。蛋白质组学。PubMedPMID:27329485.。公共医学中心PMCID:5053326

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