不需要骆驼 - 抗膜蛋白的合成纳米级

由Angela Abitua.

来自骆驼的纳米级已经得到了很多新闻对于Covid-19的治疗或预防的有希望的方法。研究人员鉴定的纳米型与冠状病毒穗蛋白(Wrapp等,2020)结合,坐落在冠状病毒表面上并使病毒能够进入宿主细胞。为此,它们将尖峰蛋白从两只不同的冠状病毒注射到骆驼上几天,并孤立的特殊骆驼抗体与细胞培养中的尖刺蛋白结合,并抑制这些病毒。

但是Llama免疫有其缺点:它需要一个骆驼醛动物设施,可以昂贵的是常规获得昂贵的,并且在试图开发抗膜蛋白等膜蛋白的不稳定靶标的抗体时可能尤其具有挑战性(37.2 - 39.2°C)。Seeger实验室通过使用质粒来找到这种方法产生Sybodies,合成纳米型对穗蛋白(Walter等,2020)。不需要骆驼。

合成纳米型的优点

纳米级是小(12-15 kDa)单结构域蛋白,可有效结合蛋白质靶标,类似于抗体如何做。常见抗体的结构是Heftier(〜150kDa)和Y形,因为它含有两个大的重链和两个小光链,粘在形成与特异性抗原结合的高度可变区的“臂”。相反,纳米甲基是一种衍生自称为重链抗体(HCAB)的骆驼抗体的单个重型结构域片段。由于它们的体积小,可以在细菌中综合表达纳米粒细胞,并且它们可以靶向抗体的表位,如将隐藏在细胞表面上的分子裂缝蛋白中的抗体的表位。

抗体,HCAB和纳米曲面的比较
图1:常见抗体,HCAB和纳米谱的比较。有关更多信息,请阅读我们的次要纳米型博客帖子

一种快速选择平台,用于产生膜蛋白的Sybodies

嵌入膜中的蛋白质的抗体是棘手的,因为它们具有较少的亲水性表面,需要洗涤剂或脂质以保持折叠,并且通常比其他蛋白质不那么丰富。Seeger Lab开发了一个鲁棒体外方案这使得能够快速选择合成纳米型,称为Sybodies,在短至3周内抵抗膜蛋白靶标(Zimmermann等,2020)。设计该选择平台使得任何标准实验室都可以快速选择使用使用膜膜蛋白的SybodiesSybody Generation Toolbox.和三大步骤中的商业上可获得的试剂 - 无需找到骆驼农场!

要查找最佳绑定的系统,您希望从大型和多样化的Sybodies开始,假设对目标蛋白质强烈粘合的池。Seeger Lab设计了3个不同的MRNA Sybodic图书馆,用于协议,涵盖3个自然发生的纳米曲面结构(凹形,环路和凸)。这些3 mRNA文库中的每一个都具有凹形,环或凸起支架,并且在与抗原结合的区域中,用定义的不同三核苷酸(对应于不同的氨基酸)随机化。Seeger Lab可以直接以MRNA的形式提供学术研究的三个系统图书馆。

用于生成您自己的库的模板质粒也可以在Sybody Generation Toolbox Plasmid Kit中提供:sb_concave.sb_loop.sb_convex.。这些支架含有可在职位的丝氨酸和苏氨酸随机创建图书馆(Zimmermann等,2018)。

找到Sybody Generation Toolbox!

从文库和生物素化(用于纯化目的)的感兴趣的蛋白质目标,该方案通过3个主要步骤来选择最佳的候选人。

系统选择策略从核糖体显示开始,然后移动到噬菌体展示,最后是ELISA。
图2:对膜蛋白选择Sybodies的过程概述。图片来自Zimmermann等人。,2018年

核糖体显示器

Seeger实验室从使用核糖体显示器的“预富集”选择步骤开始,因为它具有较大的初始起始库大小(最多10个)的优势12.成员)与使用噬菌体和酵母的其他显示系统相比(109.-1010.成员)。该选择步骤涉及使用商业试剂盒进行MRNA文库的体外翻译。图书馆中的每个mRNA分子不能编码止芯密码子,这使得核糖体在mRNA分子的末端暂停,形成由翻译的蛋白质(体内),核糖体和mRNA组成的核糖体复合物。在筛选过程中,可以回收与生物素化靶蛋白结合的显示的Sybodies用于随后的步骤。

噬菌体展示

来自富集的Sybody候选者的mRNA被逆转录成有效亚克隆到噬菌体中的cDNA片段pdx_init.质粒,使用片段交换(FX)克隆技术它使用IIS型限制站点(Geertsma,2013)。一旦构建了噬菌体,它们用于产生由噬菌体组成的噬菌体文库,该噬菌体文库组成的噬菌体,其在其外壳蛋白中显示候选Sybodies以筛选与靶蛋白结合。该协议描述了通过两轮噬菌体展示,以增加目标特定的Sybodies的富集。

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)最终富集

来自噬菌体展示屏幕的丰富的Sybody池被亚克隆(使用FX克隆)进入表达载体PSB-Init.,它将MyC-Tag和His6标签附加到每个系统候选人的末尾。这些标签用于最终的富集步骤中,用于鉴定强烈且特异性地与感兴趣蛋白质结合的Sybodies。Seeger Lab使用了描述的ELISA技术在他们的协议中因为它易于识别非特异性和低亲和力的Sybodies(Zimmermann等,2020)。该协议的该步骤从与ELISA板结合的抗Myc抗体开始,以捕获Myc标记的Sybodies。然后,加入生物素化的靶蛋白并在几次洗涤后,使用比色反应检测结合。

在ELISA步骤之后,测序狭窄的池(通常为10-30)候选物被测序以进行鉴定。所有独特的Sybodies都可以括起来PBXNPH3.或者PBXNPHM3.表达质粒用于生产无标签蛋白,用于进一步表征和分析。

在对Covid-19大流行的快速反应中,Seeger实验室证明他们可以使用该协议迅速识别和孤立Sybodies靶向在膜结合的尖峰蛋白上发现的SARS-COV-2受体结合结构域,在一个显着的12个工作日内。虽然实验室使用这种用于Covid-19研究的方法,但该协议持希望为其他疾病或研究其他膜结合的蛋白质开发治疗方法。

可以找到此系统选择平台的完整协议这里相关质粒可用Sybody Generation Toolbox套件

找到Seeger Lab的SARS-COV-2 Sybodies!


参考

  • GEERTSMA ER(2013)FX克隆:一种多功能高通量克隆系统,用于酶变体表征。在:分子生物学中的方法。人类新闻,第133-148页。https://doi.org/10.1007/978-1-62703-293-3_10
  • Walter J等人。(2020)靶向SARS-COV-2受体结合结构域的合成纳米型。生物XIV。https://doi.org/10.1101/2020.04.16.045419.
  • Wrapp D,De Vlieger D,Corbett Ks,Torres Gm,Wang N,Van Baseam W,Roose K,Van Schie L,Hoffmann M,PöhlmannS,Graham BS,Callewaert N,Schepens B,Saelens X,Mclellan JS(2020)单结构域骆驼抗体具有含贝葡萄球菌的结构基础。电池181:1004-1015.E15。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.031
  • Zimmermann I,Egloff P,Hutter Caj,Kuhn Bt,BräuerP,纽斯特德S,道森RJP,Geertsma Er,Seeger Ma(2020)产生了对精致蛋白质的合成纳米型。自然协议15:1707-1741。https://doi.org/10.1038/s41596-020-0304-x.
  • Zimmermann I,Egloff P,Hutter Ca,Arnold FM,Stohler P,Bocquet N,Hug Mn,Huber S,Siegrist M,Hetemann L,Gera J,Gmürs,Spies P,Gygax D,Geertsma Er,道森RJ,Seeger Ma(2018)膜蛋白构象诱捕的合成单结构域抗体。Elife 7:。https://doi.org/10.7554/elife.34317

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