不需要羊驼-合成纳米体对抗膜蛋白

由安吉拉Abitua

来自骆驼的纳米体很多媒体报道是治疗或预防COVID-19的一种有前途的方法。研究人员确定nanobodies与冠状病毒刺突蛋白结合(Wrapp等人,2020年),刺突蛋白位于冠状病毒表面,使病毒能够进入宿主细胞。为了做到这一点,他们在几天内将来自两种不同冠状病毒的刺突蛋白注入骆驼体内,并分离出特殊的骆驼抗体,这些抗体在细胞培养中与刺突蛋白结合,并抑制这些病毒。

但是Llama免疫有其缺点:它需要一个骆驼醛动物设施,可以昂贵的是常规获得昂贵的,并且在试图开发抗膜蛋白等膜蛋白的不稳定靶标的抗体时可能尤其具有挑战性(37.2 - 39.2°C)。Seeger实验室通过使用质粒来找到这种方法合成合成纳米体对抗刺突蛋白(Walter等,2020)。不需要骆驼。

合成纳米体的优点

纳米体是一种小的(12-15 kDa)单域蛋白质,可以有效地与蛋白质靶点结合,类似于抗体。普通抗体的结构更重(约150 kDa),呈y形,因为它包含两条大的重链和两条小的轻链,这两条轻链突出形成“臂”,“臂”中包含与特定抗原结合的高度可变区域。相比之下,纳米体是一个单一的重结构域片段,来源于一个被称为重链抗体(HCab)的驼峰抗体。由于纳米体的体积小,它们可以在细菌的质粒中合成表达,它们可以瞄准抗体难以到达的表位,比如隐藏在细胞表面分子裂缝中的蛋白质。

抗体、HCab和纳米体的比较
图1:常见抗体,HCAB和纳米谱的比较。有关更多信息,请阅读我们的二级纳米体博客

针对膜蛋白生成共体的快速选择平台

开发针对膜内蛋白质的抗体是很棘手的,因为它们的亲水性表面更少,需要洗涤剂或脂质保持折叠,而且通常比其他一些蛋白质含量更少。西格实验室开发了一种健壮的体外协议能够在短短3周内针对膜蛋白目标快速选择合成纳米体(称为sybodies) (Zimmermann等人,2020年)。该选择平台的设计使任何标准实验室都可以快速选择目标膜蛋白的共体使用Sybody代工具箱商业上可获得的试剂分三个主要步骤——所有这些都不需要找到一个羊驼农场!

要查找最佳绑定的系统,您希望从大型和多样化的Sybodies开始,假设对目标蛋白质强烈粘合的池。Seeger Lab设计了3个不同的MRNA Sybodic图书馆,用于协议,涵盖3个自然发生的纳米曲面结构(凹形,环路和凸)。这些3 mRNA文库中的每一个都具有凹形,环或凸起支架,并且在与抗原结合的区域中,用定义的不同三核苷酸(对应于不同的氨基酸)随机化。Seeger Lab可以直接以MRNA的形式提供学术研究的三个系统图书馆。

用于生成自己的库的模板质粒也可以在Sybody生成工具箱质粒工具包中找到:SB_concave,SB_loop,SB_convex。这些支架包含丝氨酸和苏氨酸在可以随机创建库(Zimmermann等人,2018)。

找到Sybody一代工具箱!

从文库和感兴趣的生物素化(纯化目的)蛋白靶点开始,该方案通过3个主要步骤来选择最佳的sybody候选体。

Sybody的选择策略从核糖体展示开始,然后转移到噬菌体展示,最后是ELISA。
图2:针对膜蛋白的共体选择过程的概要。从图片Zimmermann等人,2018年

核糖体展示

Seeger实验室从使用核糖体显示的“预富集”选择步骤开始,因为它的优势是从一个较大的初始库开始(多达10个12与其他使用噬菌体和酵母的展示系统相比(109-10年10成员)。这个选择步骤涉及到使用一个商业试剂盒在体外翻译mRNA库。文库中的每个mRNA分子都不编码一个终止密码子,终止密码子导致核糖体在mRNA分子的末端停顿,形成一个由转译蛋白(sybody)、核糖体和mRNA组成的核糖体复合体。在筛选过程中,显示的与生物素化的目标蛋白结合的联体可以被回收用于后续步骤。

噬菌体展示

然后,从sybody候选基因富集池中提取的mRNA逆转录成cDNA片段,这些片段被高效地亚克隆到噬菌体中pDX_init质粒,使用片段交换(FX)克隆技术使用IIS类型限制站点(Geertsma, 2013)。一旦噬菌体被构建,它们就被用来产生一个噬菌体库,由噬菌体组成,这些噬菌体在它们的外壳蛋白中显示候选共体,以筛选与目标蛋白的结合。该方案描述了通过两轮噬菌体展示来增加目标特异性sybody的富集。

酶联免疫吸附法(ELISA)最终富集

将噬菌体显示屏上的富集sybody池亚克隆(使用FX克隆)到表达载体中pSb-Init,它将myc标签和his6标签附着在每个sybody候选人的末尾。这些标签在最后的富集步骤中用于识别与目标蛋白强烈而特异地结合的共体。Seeger实验室使用了上述ELISA技术在他们的协议因为它不太容易识别非特异性和低亲和力的sybodies (Zimmermann et al., 2020)。该方案的这一步首先将抗myc抗体与ELISA板结合,以捕获myc标记的共体。然后,加入生物素化的目标蛋白,经过几次洗涤后,用比色反应检测结合。

在ELISA步骤之后,缩小的筛选池(通常是10-30个)的sybody候选体被测序以进行鉴定。所有唯一的sybody都可以被亚克隆到pBXNPH3或者pBXNPHM3表达质粒用于生产无标签蛋白,用于进一步表征和分析。

在对COVID-19大流行的快速反应中,西格实验室证明他们可以使用该方案快速识别和分离共体靶向SARS-CoV-2受体结合域的膜结合棘突蛋白,在显著的12个工作日。虽然该实验室将这种方法用于COVID-19研究,但该方案有望开发其他疾病的治疗方法或研究其他膜结合蛋白。

此系统体选择平台的完整协议可以找到在这里相关的质粒在Sybody Generation工具箱

找到西格实验室的SARS-CoV-2病毒携带者!


参考

  • FX Cloning: A Versatile High-Throughput Cloning System for Characterization of Enzyme variant . Geertsma ER (2013) FX Cloning: A Versatile High-Throughput Cloning System for Characterization of Enzyme variant . FX Cloning: A Versatile High-Throughput Cloning System for Characterization of酶变体。见:分子生物学方法。Humana出版社,第133-148页。https://doi.org/10.1007/978-1-62703-293-3_10
  • Walter J等人(2020)针对SARS-CoV-2受体结合域的合成纳米体。BioRxiv。https://doi.org/10.1101/2020.04.16.045419
  • Wrapp D, De Vlieger D, Corbett KS, Torres GM, Wang N, Van Breedam W, Roose K, Van Schie L, Hoffmann M, Pöhlmann S, Graham BS, Callewaert N, Schepens B, Saelens X, McLellan JS(2020)利用Camelid单域抗体有效地抑制乙型病毒的结构基础。细胞181:1004 - 1015。e15。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.031
  • Zimmermann I, Egloff P, Hutter CAJ, Kuhn BT, Bräuer P, Newstead S, Dawson RJP, Geertsma ER, Seeger MA(2020)针对精细蛋白质的合成纳米体。自然协议15:1707 - 1741。https://doi.org/10.1038/s41596-020-0304-x
  • Zimmermann I, Egloff P, Hutter CA, Arnold FM, Stohler P, Bocquet N, Hug MN, Huber S, Siegrist M, Hetemann L, Gera J, Gmür S, Spies P, Gygax D, Geertsma ER, Dawson RJ, Seeger MA(2018)用于膜蛋白构像捕获的合成单域抗体。eLife 7:。https://doi.org/10.7554/elife.34317

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