轻松标记您最喜欢的酵母基因

由朱利安泰勒 - 帕克

在显微镜下荧光标记酵母细胞同源重组是该方法,几乎​​所有寿命修复基因组损伤,特别是双链断裂。研究人员长期利用这种自然过程将蛋白质标签整合到基因组中S. Cerevisiae.S. Pombe.。该方案令人惊讶的是简单,只需要含有含有大约50个碱基对插入染色体位点的修饰序列的PCR产物。通过直接转化将线性PCR产物引入细胞中。给定的插入物通常含有蛋白质修饰序列和可选择基因产物,用于分离成功的转化体。

Addgene分配了几种即用的模块化质粒,组合荧光标签,表位标签,蛋白酶和选择标记。这些在蛋白质复合研究中特别有用,其中需要多种蛋白质产品的标记,因为多个选择标记可以确保已经整合了所有所需的标签。只需用所需的靶向同源框架设计放大底漆,当然 - 并开始标记!

酵母优化的成像荧光团

在显微镜下荧光标记酵母细胞
Lee S等人。(2013)PLO一个8(7):E67902。

许多成像研究依赖直接融合荧光蛋白vwin德赢娱乐平台(FPS)对感兴趣的酵母基因。这些荧光标记的基因在天然条件下表达,并且允许科学家不仅可以跟踪个体蛋白质的丰度,运动和定位,还可以通过褶皱来研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。Sidae Lee,Wendell Lim., 和Kurt Thorn.在UCSF最近开发了一系列的蓝色,绿色和红色FPS,该FPS是专为在酵母中表达而优化的密码子。这些标记矢量基于先前描述的PFA6A-Link载体,并包括KAN,SPHIS5或CAURA3选择标记。Lee等人。(1)评估许多这些荧光标签S. Cerevisiae.,在亮度,稳定性和标记蛋白的亮度,稳定性和破坏等类别中展望他们的性能。根据他们的调查结果,作者推荐最佳的FP组合用于酵母成像,由特定的滤波器组分类和实验输出要求。从而选择酵母优化荧光团标记矢量对于您的单色或多色成像实验。

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对展位标签有兴趣吗?

其他人可能会感兴趣附加表位标签对他们的感兴趣的基因,允许容易地捕获和检测蛋白质和复合物,而没有有时与基于质粒的过表达相关的伪影。Tim Formosa.,在犹他大学,建立了一个完整的酵母标记模块的集合通过蛋白酶位点(TEV或PRESCASSION)的每种可能组合,表位标签(12xHIS,2xSTREP,3xFLAG,蛋白A或V5),以及选择标记(KANMX,HPHMX或HIS3MX)。来自该系列的每个PCR产物将产生具有格式(蛋白酶位点)-6xgly接头 - (表位标签)-ADH1终止子 - (选择标记)的插入物。另外,Formosa博士已经用多个克隆部位沉积了六种质粒,代替表位标签以产生您自己独特的蛋白质融合。这个系列非常适合串联亲和力净化蛋白质复合物。

John Pringle.JürgBähler.已经沉积了大量的质粒,用于在Unc Chapel Hill的Pringle的前实验室开发的酵母中进行基因组改性。bähler等。(2)描述一个模块化的集合质粒用于各种基因组修饰S. Pombe.,包括全部和部分基因删除过度表达(通过推动者替代),和标记在N-或C-末端(3xHa,13xMyc,GST或GFP)。Longtine等人。(3)描述一套互补用于使用的质粒S. Cerevisiae.,具有多个选择标记的额外益处,用于在单个应变内结合修改。

除了上面的集合外,还有许多其他模块化酵母标记系统已经在实验室中开发安妮罗宾逊Eishi Noguchi., 和梅丽莎摩尔,命名几个。

您是否在您自己的实验室中使用过这些工具?Addgene愿意听到您的社区,了解您对酵母基因组修改的经验。在哪些方面具有最基因标记系统,使您能够提升您的研究?你有一个在这里没有提到的最喜欢的标记系统吗?


参考:

  1. Lee S,Lim Wa,Thorn Ks。普罗斯一体。2013年7月2日; 8(7):E67902。
  2. BählerJ,吴杰克,Longtine Ms,Shah Ng,McKenzie A 3,Steever Ab,Wach A,Philippsen P,Pringle JR。酵母。1998年7月(10):943-51。
  3. Longtine Ms,McKenzie A 3,Demarini DJ,Shah Ng,Wach A,Brachat A,Philippsen P,Pringle Jr。酵母。1998年7月(10):953-61
笔记:Marcy Patrick有助于写这篇文章。

话题:酵母质粒标签质粒

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