标记光遗传学和化学遗传学受体:荧光蛋白和其他选项vwin德赢娱乐平台

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本文由埃默里大学医学院副教授Adriana Galvan撰稿。

光遗传学和化学遗传学是调节神经元和其他脑细胞活动的有力工具。由于在这些技术中使用的视蛋白或趋化受体不能直接用荧光或免疫组化方法显示,这些蛋白质通常融合在一起“标记”或“标记”蛋白质便于检测。

vwin德赢娱乐平台荧光蛋白是应用最广泛的标记,因为它们发出内源性荧光,在适当的荧光照明下易于检测体内,体外,或者说是事后实验。vwin德赢娱乐平台荧光蛋白也可以通过抗体和免疫组化技术鉴定。因此,这些蛋白质提供了一种通用的方法来识别转基因表达感兴趣。此外,荧光团变体(例如绿色和红色荧光蛋白)允许同时识别多个感兴趣的蛋白质。vwin德赢娱乐平台

然而,根据我们的经验,我们发现荧光蛋白可能并不总是最好的选择。vwin德赢娱乐平台

vwin德赢娱乐平台荧光蛋白会干扰融合蛋白的功能

在某些情况下,融合的荧光蛋白可能是目标蛋白表达的障碍,而不是辅助。vwin德赢娱乐平台绿色荧光蛋白(GFP)和mCherry是目前最常用的两个标签,大约有240个氨基酸大小。这些蛋白质的大小,或者它们之间的二聚,可能会影响融合蛋白的特性或运输(Kimple等,2013)。

我们发现,荧光蛋白确实可以干扰目标蛋vwin德赢娱乐平台白的正确功能。在我们的研究中,我们使用AAV病毒载体vwin668表达hM4Di在神经元对恒河猴或小鼠进行研究(Galvan等,2019年)。的hM4Di受体是一个工程Gprotein-coupled受体,其中之一设计受体只被设计药物激活(dreadd) (Armbruster等,2007)。

我们最初使用的结构是将hM4Di与mCherry融合在一起。为了研究hM4Di的定位,我们使用了针对mCherry的一抗和偶联纳米金粒子的二抗,这使得蛋白质定位具有高空间分辨率。令人惊讶的是,我们在电子显微镜下的观察显示,在猴子神经元中,大部分的金颗粒在树突的细胞质中,只有一小部分在质膜上(图1的上半部分)。当然,这是有问题的,因为DREADD受体需要位于质膜上,在给药后由DREADD致动器激活。虽然我们发现小鼠神经元的细胞膜上有较大的比例,但大部分仍是细胞质。

使用“小”标签来识别蛋白质

考虑到hM4Di‐mCherry在猴子神经元质膜上的有限表达,我们接下来假设融合在hM4Di上的不同标记可能会改善该DREADD向质膜的运输。的血凝素(HA)标记是流感病毒血凝素的一个小的9个氨基酸表位,30多年前被引入融合蛋白领域(field et al., 1988)。因此,我们在小鼠和猴子的大脑中注射了携带hM4Di-HA的aav。令人惊讶的是,我们发现这个小小的改变会产生很大的影响。将mCherry替换为HA标签后,hM4Di在两种植物的质膜中均得到了丰富的表达(图1的底部)。

我们的结果表明,标签蛋白可能对转基因感兴趣基因的表达及其在膜中的定位有重要的影响。我们从这些研究中得到的教训是,标签蛋白可以影响转基因感兴趣的表达。在我们的研究中,mCherry干扰了dreadd细胞膜的转运。在不需要荧光的研究中,使用HA和其他短表位标记(Kimple et al., 2013)可以帮助改善蛋白质在细胞膜上的转运。

电镜显示hM4Di在细胞质中残留着mCherry,而hM4Di- ha定位在质膜上。

图1:猴子中hM4Di的超微结构定位电镜图像。采用免疫金预包埋技术显示hM4Di偶联mCherry(上)或HA标签(下)。这些图像显示了猴子杏仁核中的树突(蓝色阴影)。红色和绿色箭头分别指向位于细胞质内或结合在质膜上的金粒子。值得注意的是,HA标签的使用显著提高了hM4Di向质膜的转运。

我们的研究提供了证据,一些荧光蛋白可以,在某些情况下,有害的表达蛋白的利益。vwin德赢娱乐平台然而,我们也发现这并不适用于所有的融合蛋白。例如,我们发现另一种DREADD, hM3Dq,即使与mCherry融合,也能在质膜上成功表达。但我们的数据确实强调了对转基因表达进行仔细鉴定的重要性。

我应该使用哪个标签?

在决定合适的标签时,实验设计应该是主要的指导。我们的研究结果表明,当荧光不是识别视蛋白或化学发生受体表达的必要条件时,非荧光标记可能优于荧光蛋白。vwin德赢娱乐平台然而,在某些情况下,荧光信号可能对实验至关重要。由于融合蛋白可能阻碍目标蛋白的成功表达,另一种方法是与视蛋白或化学发生受体通过双反子表达荧光蛋白IRES或2A序列.在这种情况下,蛋白质没有融合。标签蛋白将在同一细胞中表达,但不一定与视蛋白或化学发生受体在同一亚细胞室。这在许多研究中可能不是一个重要的限制,甚至在某些类型的实验中可能是有益的(例如,当神经磷脂表达的荧光掩盖了视蛋白表达细胞的识别)。

当进行荧光蛋白融合时,要记住其他事情,请查看Joachim Goedhart在Addgene博客上的文章:vwin.com mobilevwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:GFP融合蛋白-正确连接

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阿德里亚娜Galvan头像感谢我们的嘉宾博主!

阿德里亚娜·加尔文(Adriana Galvan)是埃默里大学医学院的副教授,也是耶基斯国家灵长类动物研究中心的研究员。使用以下组合在活的有机体内通过解剖技术,她的研究旨在加深对运动障碍中基底神经节的生理学和病理学的理解。

引用和资源

参考文献

Armbruster BN, Li X, Pausch MH, Herlitze S, Roth BL(2007)进化锁与钥匙相匹配,创造了一个被惰性配体有效激活的G蛋白偶联受体家族。国家科学院学报104:5163-5168。https://doi.org/10.1073/pnas.0700293104

Field J, Nikawa J, Broek D, MacDonald B, Rodgers L, Wilson IA, Lerner RA, Wigler M (1988) synthesis and characterization of a RAS-responsive adenyl cyclase complex from a酿酒酵母利用表位添加法。分子细胞生物学8:2159-2165。https://doi.org/10.1128/mcb.8.5.2159

Galvan A, Raper J, Hu X, Paré J, Bonaventura J, Richie CT, Michaelides M, Mueller SAL, Roseboom PH, Oler JA, Kalin NH, Hall RA, Smith Y(2019)猴子DREADD s的超微结构定位。欧洲J神经科学50:2801-2813。https://doi.org/10.1111/ejn.14429

亲和标签在蛋白质纯化中的应用。蛋白质科学当前协议73:。https://doi.org/10.1002/0471140864.ps0909s73

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