针对CRISPR的艾滋病毒 - 1:休克和杀死或削减它?

由玛丽传动装置

玛丽传动


CRISPR HIV.目前有超过2500万人全世界都被感染了
慢病毒HIV-1。如今,HIV-1可以用抗病毒疗法控制,使得病毒在血液中不可检测。但病毒并不完全消失;它只是在潜伏的细胞中隐藏。为了真正治愈HIV-1,研究人员需要征服这些隐藏的病毒水库,而CRISPR可能是实现这一艰难工作的方式!Kamel Khalili的实验室在寺庙大学展示了克里普尔艾滋病毒治疗方法的两种潜在策略 - 一种使用DCAS9-SAM为了激活HIV-1转录并破坏感染的细胞,另一个使用野生类CAS9从受感染的细胞中除去HIV-1基因组。继续阅读,了解CRISPR在体外可能会如何服用HIV-1,以及临床成功必须克服障碍。

艺术和HIV-1水库

HIV-1感染免疫系统中的细胞,特别是CD4 + T细胞,并最终导致未经处理的个体中获得免疫缺陷综合症(艾滋病)。艾滋病的症状包括快速减肥和感染风险增加,包括常见的感染和机会性感染通常在健康的人中通常看不到。抗逆转录病毒治疗(ART)几乎可以消除血浆HIV-1,改善HIV-1患者的寿命和质量。然而,艺术不是HIV-1治愈。在止损术的患者中,由于位于潜伏的细胞中的病毒储层,病毒水平将很快飙升到预处理水平。虽然艺术治疗的患者缺乏血浆HIV-1,但它们对其他慢性疾病的风险增加,包括痴呆,肠道疾病,神经损伤和心脏病。这种增加的疾病风险是归因于潜伏的艾滋病毒储层,慢性炎症和艺术的负代谢效果。

为什么身体不能摧毁免疫反应来摧毁这些水库?基本上,免疫系统并没有看到它应该回应的任何威胁。潜伏的细胞逃避免疫检测,因为它们产生很少或没有病毒蛋白。为了解决这个问题,提出了两种策略。

首先,“休克和杀死”,旨在重新激活潜伏的艾滋病毒,以便通过细胞毒性或免疫应答来产生病毒蛋白并死亡。第二次策略是从感染细胞中简单地除去HIV-1基因组,这是一个想法,这一想法随着CRISPR的出现而变得更加现实。

使用CRISPR / CAS9 SAM到“震惊和杀戮”

使用休克和杀死战斗HIV-1

“休克和杀死”艾滋病毒感染的储层,研究人员以前使用的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂增加了综合HIV-1基因组的转录。对于目标方法,张等人。转向了CRISPR / CAS9协同激活调解员(SAM)系统可从addgene获得。该系统使用常用于激活转录的DCAS9-VP64融合,但是用两个额外的激活域(MS2和P65)来增强转录激活。

张等人。designed multiple gRNAs to target the 5’ long terminal repeat (LTR) of the HIV-1 genome, which acts as a promoter, and found that SAM targeting of the enhancer region near the NF-KB binding sites increased activation of HIV promoter-luciferase constructs. In multiple HIV-1 latent T cell lines, as well as a latent microglial line, treatment with CRISPR/Cas9 SAM increased the percentage of cells with activated HIV-1, measured via HIV-1 promoter-driven GFP expression. In cell lines that can produce HIV-1 toxic proteins, CRISPR/Cas9 SAM caused apoptosis, indicating a true “shock and kill” response.

用CRISPR / CAS9切出基因组中的HIV-1

用CRISPR切割HIV-1从基因组出来

在引入CRISPR之前,用ZFN和TALENS进行HIV-1基因组编辑,主要用于破坏CCR5,HIV-1用于进入细胞的受体。ZFN和CRISPR / CAS9也已被用于在基因中产生对HIV-1复制至关重要的突变。然而,这种方法可以允许一些病毒蛋白质产生,因此研究人员也对从感染的细胞精确地切除HIV-1基因组感兴趣。ZFN用于验证概念研究,但研究人员认为,使用CRISPR / CAS9可以提高效率并降低偏移效应的概率。

在这种疗法中,CRISPR / CAS9需要1.从每个受感染的细胞中切除HIV-1基因组,2.防止那些细胞的再感染。Kaminski等人。设计GRNA以瞄准HIV-1 5'和3'LTR,并在T细胞线2D10中与CAS9一起表达它们。合并样品的PCR扩增和Sanger测序显示,大多数HIV-1基因组被切除,仅留下连接在一起的一小部分LTR。表达克隆CAS9 / GRNA表达细胞群也免受HIV-1再灌注。

重要的是,没有检测到偏离目标效果。Kaminski等人。观察到对CAS9 / GRNA表达的细胞活力,细胞周期进展或细胞凋亡没有负面影响。汇总分析发现,在预测的偏离靶位点处没有Cas9裂解的证据,该网站高达7个不匹配到GRNA靶序列。

Kaminski等人。接下来在HIV-1感染的T细胞中测试了它们的程序,看看它们是否可以通过CRISPR救出。CD4 + T细胞与健康个体分离,膨胀,感染HIV-1。对于两个HIV-1菌株,Cas9 / GrNA慢病毒表达显着降低了HIV-1拷贝数,但效率在菌株之间的48-100%差异。在类似的实验中,CRISPR在来自两个HIV-1受感染患者的分离的CD4 + T细胞中减少了HIV-1拷贝数超过50%。虽然这是一个令人兴奋的发现,但重要的是要注意,这些HIV-1患者是艺术 - 天真的,因此该实验模拟了活性HIV-1感染期,而不是大多数HIV-1患者中发现的艺术诱导的病毒对照。

CRISPR HIV-1治疗的障碍

这两种方法都代表了在动物模型中应追求的临床前HIV-1研究中的令人兴奋的进步,并且难以判断一种方法是否可能更成功。“休克和杀死”具有杀死感染HIV-1的细胞的优点,以消耗病毒储层,这种方法不需要功能性Cas9核酸酶,因此无异常DNA裂解的可能性。直接HIV-1裂解允许T细胞存活,但预防再感染可能需要CAS9 / GRNA的持续表达,这可能导致脱靶切割的较高速率。

在这两种情况下,将体外工作转化为动物模型附带两个关键的障碍。首先是将CRISPR机制的交付给所有靶细胞。考虑到病毒储层跨越多器官系统,这一目标可能特别困难。当HIV-1限于T细胞的子集时,两种方法可能会早期提前成功,但如果可以达到足够的T细胞以烧蚀良好的病毒储层,则目前尚不清楚。

CRISPR HIV-1疗法的第二次挑战是序列特异性。然而,抗病毒治疗蛋白质结构水平的HIV-1,CRISPR GRNA需要DNA序列特异性结合。Patients’ HIV-1 genomes will need to be sequenced to determine the optimal gRNAs for either “shock and kill” or viral excision approaches, and each of these gRNAs will need to be validated for high on-target binding and low off-target binding. It’s also possible that HIV-1 may evolve resistance to CRISPR therapies through PAM or seed sequence mutations. Multiple gRNAs could be used to combat this problem, just as ART includes multiple drugs to lower the odds of developing resistance.

Kaminski等人之后不久。发表了结果,王等人。显示HIV-1可以逃离靶向LTR或基因的CRISPR / CAS9诱导的修饰。这些逃生突变中的许多都位于Cas9切割位点附近,领先王等人。为了得出一些Cas9衍生的诱导,可能不会消融病毒功能,而是促进对CRISPR / CAS9的抵抗力。虽然这些结果是令人沮丧的,但重要的是要注意,这些实验是在细胞培养中进行的,并且仅在Cas9 / GrNA的稳定表达后感染HIV-1的细胞。此模型中的病毒生产比潜伏的HIV-1感染更高,这将使“逃生”病毒更容易传播和感染相邻的细胞。确定在动物模型中是否发生CRISPR / CAS9逃生将是很重要的。如果这些逃逸突变频繁,则DCAS9介导的“休克和杀灭”策略可能是比直接切割更好的选择。

尽管在将这些发现转化为治疗方面潜在潜在困难,但这些论文目前诱人的证据表明HIV-1治愈可能在我们的范围内。类似的研究表明,CRISPR可用于解决其他病毒感染,特别是小鼠模型H表情炎B.,一种感染超过2.5亿人的疾病。正如我们以前在CRISPR字段中看到的那样,在追求一个技术应用程序中汲取的经验教训可以使许多其他人受益并加速研究的步伐。我们在Addgene希望看到体内Crispr的问题在未来几年内更具易行,因为它将为一些世界上最常见的疾病开辟许多新的治疗可能性。


参考

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Khalili K,Kaminski R,Gordon J,Cosentino L,Hu W.基因组编辑策略:消除HIV-1 /艾滋病的潜在工具。J Neurovirol。2015年6月21日(3):310-21。PubMed.PMID:25716921

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