教一条古老的狗新技巧:用GFP控制蛋白质活动

由玛丽传动装置

玛丽传动

在Addgene,我们爱GFP.,我们当储户找到新的方法,使更加有用这个主力蛋白质总是兴奋!从FPS优化用于氧化环境可光电型号,似乎GFP总是学习新事物。现在,工作Connie Cepko的实验室允许研究人员仅在GFP存在下激活转录或CRE重组酶活性。这些系统,称为T-Ddog.克雷狗,分别重新调整为更复杂的实验操作流行的GFP记者行,节省了时间和金钱,需要开发新的生产线。

使用纳米级以创建转录激活的GFP支架

该项目开始令人沮丧,许多研究人员都经历过:想要询问和回答实验问题,但没有所需的工具。Cepko Lab研究员Jonathan Tang希望在鼠标中表达单个细胞类型中的各种蛋白质,但知道开发此目的所需的鼠标线需要数年。唐想知道他是否可以使用以前建立的鼠标线,以特定的小区类型表达GFP,以不仅仅是标签单元格。如果可以共选择GFP以控制基因表达,则他可以选择性地仅操纵GFP标记的细胞。

一旦唐和蝉发现了GFP结合纳米型的描述,该项目真的起飞了。不像大多数抗体,纳米抗体,其天然存在于骆驼,由单一的重链,和它们小且稳定的细胞内。Nanobodies结合GFP是在2009年设计的。随后的工作表明,纳米级可以融合给其他蛋白质,这些融合保留了结合GFP的能力。

利用绿色荧光蛋白作为支架的想法突然变得很现实。设想GFP作为促进二聚化的底物,Tang等人。测试对它们的GFP结合蛋白(GBPS)对,以找到可以共同占用GFP的那些。一旦他们找到合适的成对,它们就会构建了三个组件:GBPA-VP16(激活域);GBPB-GAL4(DNA结合域);和一个uas驱动的荧光素酶记者构建。在没有GFP的情况下,在其293个细胞培养系统中没有观察到记者产出。在用GFP和GBPS的细胞中分配,GFP将两个GBP连接在一起以产生完整的转录因子,激活荧光素酶转录。Tang等人。创造了这个系统t-ddog(T.巡洋诗D.evD.句子O.NGFP)。

T-DDog来自CEPKO实验室的转录因子

在测试其系统的特殊性时,TANG等人。发现了yfp.CFP.可以类似于GFP激活某些T-DDog构造,但常用红色荧光vwin德赢娱乐平台蛋白DSRED,MCHERRY和TDTOMATO不诱导转录。因此,T-Ddogs可以与绿色组合使用CRE-LOX.系统。T-DDOGs还可以设计与其他DNA结合结构域,包括常用的lexa.rtetr.它们使得它们激活来自不同启动子的基因表达。

搬到了体内系统,Tang等人。将T-Ddogs,GFP和报告器构建到小鼠视网膜中。GFP表达鲁棒地激活了报告基因Tdtomato,其表达不存在而没有电穿孔的GFP。然后,他们用两只小鼠GFP报告线测试了T-Ddogs;同样,TDTOMATO仅在具有GFP的细胞中观察,高激活频率为56-93%。在逆转试验中,98%的TDTOMATO表达细胞是GFP +,表明坚固但特定的系统。T-Ddogs也成功地调节了表达ChannelRhodopsin-2,常用于Optimetics.,开辟特定细胞群体中适应光学遗传学实验的GFP线的可能性。

听取我们的播客与Connie Cepko采访

将CRE和GFP与CRE-DOGS结合起来

T-DDOG结果表明,GFP可以以细胞型特异性方式调节转录,唐和谱急于看出它们是否可以将GFP调节应用于其他类型的蛋白质。他们开始了另一种生物训练,CRE重组酶, 哪一个诱导重组在Loxp网站。放置一个lox-stop-lox当不存在CRE时,感兴趣的基因上游的盒子障碍转录。当存在CRE时,它去除止动盒,激活基因表达。

虽然CRE不是模块化蛋白质,但唐等。AL.能够创建仅在Gbps / GFP二聚中时才能激活的CRE的拆分版本。新系统,CRE-DOG(克瑞斯D.句子O.NGFP)由GFP和衍生物GFP和YFP激活,但不是红色荧光蛋白,如T-Ddogs所示。vwin德赢娱乐平台

Cre-Dog分离Cepko实验室的重组酶系统工程

像T-Ddogs一样,Cre-Dog都是坚固且特定的。当在视网膜电穿孔研究中测试时,DSRED报告表达诱导在约76%的GFP +细胞中,100%的DSRED +细胞也表达了GFP。使用AAV.建筑,唐等。发现Cre-Dog可以在整个神经系统中递送,包括电机皮质,小脑和脊髓。Cre-Dog也适用于致敏性研究,并且由于感染AAV-Cre-Dog的细胞保留正常的神经元功能,因此该系统可以使特定细胞群体中的光学学更容易。

优点和其他可能性

很明显,Cre-Dog和T-Doggs为GFP标记的线条开辟了许多新的可能性,每个人都有自己的优势。可以使用Retorm系统制成药物诱导的T-DOGGS,但CRE-DOP缺乏具有高水平转录激活结构域可以看到的毒性。这两种系统很容易适应神经科学的应用,包括光遗传学,他们应该使它更容易在神经系统进行功能研究。

更广泛地,Cepko和Tang注意其脚手架系统可能适用于许多类型的蛋白质。对于具有模块化结构的蛋白质,构建分裂变体应该相对简单,但也可以产生像CRE这样的非模块化蛋白的分裂版本。可以Cas9.-DOG发展很快,仅允许在细胞中的一小部分的基因组修改?其他蛋白质也可以用作支架,包括该组红色荧光蛋白。vwin德赢娱乐平台

T-Doggs.克雷狗可从Addgene公司,我们很渴望看到你如何在您的研究中使用它们!


参考

1. Z,Jonathan C.Y.等。“使用荧光蛋白为基于纳米体的系统,作为细胞特异性基因操纵的支架vwin德赢娱乐平台。”细胞154(4)(2013):928-939。PubMed.PMID:23953120。pmed中央PMCID:PMC4096992.

2.唐,乔纳森C.Y.等。“具有GFP依赖性CRE重组酶的细胞类型的操纵。”NAT。Neurosci。18(9)(2015):1334-1341。PubMed.PMID:26258682

3. Kirchhofer,A.等。“使用纳米型蛋白质的蛋白质特性的调节。”NAT。结构。摩尔。BIOL。17(2010):133-138。PubMed.PMID:20010839.

4. Caussinus,E.,Kanca,O.和携带,M。“由抗GFP纳米谱介导的荧光融合蛋白淘汰。”NAT。结构。摩尔。BIOL。19(2012),117-121。PubMed.PMID:22157958

addgene资源

在addgene中找到Cre-lox质粒。

话题:vwin德赢娱乐平台CRE-LOX.其他荧光蛋白工具

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