这篇文章由Promega的Kyle Hooper贡献。
自从有质粒可共享以来，研究人员就一直在共享质粒。当我还在实验室的时候，如果你读了一篇论文，看到了一个你想要使用的有趣的结构，你可以自己做，也可以“通过电话克隆”。我的一位教授在电话克隆方面非常出色，他在世界各地的实验室都有实验室，他有获得他想要的质粒的具体策略和战术。Addgene使得在不同的实验室间分享你的结构变得更加容易。Promega支持Addgene使命宣言:通过改善对有用的研究材料和信息的获取，加速研究和发现。我们的许多技术平台喜欢HaloTag®融合蛋白，密码子优化的萤火虫荧光素酶基因(例如，luc2),NanoLuc®荧光素酶可以从存储库中获得。我们鼓励人们去Addgene获取新的创新工具。毕竟，当我们分享的时候，科学不是更好吗?
NanoLuc®荧光素酶基于工具的技术可以加速你的研究。NanoLuc®荧光素酶的创建从相当沉闷的19kDaOplophorusPromega 's Advanced Technologies group的荧光素酶以及Promega 's Chemistry group的coelenterzine substrate to the more stable yet brighter fumizine是一个好故事(1)。从深海虾到生物发光的小型发电站，NLuc比我们更常见的荧光素酶(如萤火虫(FLuc))亮100倍Renilla荧光素酶(RLuc)。这并不是因为你能做出多聪明的反应，而是因为你能做出多敏感的反应。通过Fluc或RLuc反应，NLuc需要少100倍的蛋白质才能产生相同数量的光。事实上，NLuc足够明亮，能够检测通过CRISPR/Cas9敲入产生的内源性标记基因。最后，NLuc只有19 kDa，非常适合用于内源性蛋白质标记。CRISPaint-NLuc结构(质粒)就是一个例子# 67178)，用于Schmid-Burgk, j.l.等(2)。
在这篇文章中，我将介绍NLuc技术的两个伟大应用。第一种是将NLuc与荧光蛋白结合制成更好的报告基因，vwin德赢娱乐平台第二种是将NLuc与荧光蛋白结合制成更好的生物传感器。
NanoLuc®-荧光蛋白融合成像
vwin德赢娱乐平台神奇的成像工具，但它们的用途是有限的吗在活的有机体内因为它们必须被外部光源激发。这些外部光源可以产生自身荧光，由于被组织吸收，穿透受限。为了避免含血红素蛋白在整个动物体内的吸收，应使用波长在600 nm或以上的光。
研究人员经常使用生物发光技术来解决这些问题，因为传统的荧光素酶发出的波长接近最佳波长(Fluc发出610纳米)，不需要外部光源。不幸的是，检测传统的荧光素酶昏暗的光发射需要很长的采集时间，这对于某些实验装置可能是不切实际的或不可行的。
NLuc的亮度引起了想要进行全动物成像研究人员的注意，但是NLuc的发射峰在460 nm，因此它不是活体成像的最佳选择。
解决方案是将Nluc与红移萤光相结合。在这里，NLuc通过一个称为生物荧光共振能量转移(BRET)的过程内部激发荧光。然后荧光发出穿透组织波长超过600纳米的光。
LumiFluors
肖布等人(3.)设计了两个成像探头。一个由NLuc融合到增强的绿色荧光蛋白(GpNluc)组成，另一个由NLuc融合到渗透性更强的橙色荧光蛋白融合(OgNLuc)组成。这两种荧光vwin德赢娱乐平台蛋白都可以被Nluc发射激发，实验室将这些融合称为LumiFluor报告。LumiFluor报告基因被设计成用于宿主细胞感染的逆转录病毒。通过流式细胞术，利用BRET报告基因的荧光部分对成功感染/表达的细胞进行分类。将分离的细胞注射到小鼠体内，并在i.p.或i.v.给药后成像。GpNLuc和OgNLuc BRET报告基因在没有外部刺激的情况下都产生了明亮的信号，而OgNLuc是最亮的，因为它的发射波长接近600纳米——这清楚地证明了为什么BRET报告基因可以改善深层组织成像。GpNLuc和OgNLuc的构造可以通过Addgene (Cat.#70185和70186分别)。
心大星
Chu, J.等人(4)，同样地，想要制造一个用于成像的BRET探针。这些作者开始设计一个更好的荧光蛋白，可以与GFP共同成像使用相同的波长的激发。结果得到了可激发青色的橙色荧光蛋白CyOFP1。CyOFP1从mneptun2进化而来，经过33个突变和2个缺失。与类似的橙色荧光蛋白相比，CyOFP1具有更高的量子产率、亮度和成熟时间。vwin德赢娱乐平台在他们的工作中，作者注意到CyOFP1是如何被NanoLuc®荧光素酶(NLuc)激发的，并着手通过连接两个CyOFP1分子到NLuc (CyOFP1-NLuc-CyOFP1;心大星)。在该模型中，将Antares或萤火虫荧光素酶质粒直接注射到小鼠肝脏，24小时后静脉注射呋马嗪或荧光素，Antares发出的信号比Fluc亮2倍以上。Antares的构造可以通过Addgene (Cat。#74279)。
增强Nano-Lanterns
铃木等人(5)使用荧光蛋白(FPs)同时在活细胞中成像多个蛋白质可能存在问题，因为激发光会导致光毒性、自身荧光和干扰生物现象。vwin德赢娱乐平台FPs与荧光素酶偶联的技术可以克服这些问题，但由于偶联荧光素酶产生的微弱信号而受到阻碍。这种策略首先是通过RLuc8实现的Renilla荧光素酶，生产一系列FP-RLuc8融合物用于多色成像。在所有这些融合中，coelenterazine激发荧光信号，这些FP-RLuc8融合被称为纳米灯笼。
RLuc8比RLuc亮5.5倍，但NLuc比RLuc8亮30倍(6)。因此，Susuki, K等人将他们的纳米灯笼中的RLuc8部分替换为NLuc，并将他们改进后的发明称为增强纳米灯笼。这些伟大的成像工具产生青色，黄色，绿色，橙色和红色的荧光。本文报道了增强纳米灯笼的广泛应用，包括监测多个细胞事件，如亚细胞结构和基因表达的动态。你一定要去看示范Ca的电影2 +动力学在心肌细胞。
增强的纳米灯笼结构可以通过Addgene:绿松石(CeNL;质粒#85199)、黄(YeNL;质粒#85201),橙色(OeNL;质粒#85202)和Red (ReNL;质粒#85203) NLuc融合。的Nagai实验室此外，已经将25种增强纳米灯笼融合到其他细胞蛋白中。
使用NanoLuc®荧光素酶的brec生物传感器
许多像钙释放这样的细胞内传感器已经通过荧光共振能量转移(烦恼)调查。这些探针通常由一个响应蛋白(如钙结合蛋白)融合到两个荧光蛋白。vwin德赢娱乐平台当反应蛋白与钙结合时，它改变构象，使两个荧光蛋白结合在一起，从而增加它们的FRET信号。vwin德赢娱乐平台FRET是一种能量从一个荧光蛋白到兼容荧光蛋白的非辐射转移。通过激发最蓝移荧光蛋白(供体)和测量这对荧光蛋白中红移荧光蛋白(受体)的合成发射，可以测量FRET。从受体发出的辐射越高，FRET信号就越强。在设计良好的基于FRET的生物传感器中，FRET信号的强度可以与特定的生物分子浓度相关联。
FRET传感器面临着光漂白、自身荧光以及光毒性等挑战。使用FRET传感器的另一个挑战是使用光基因调控器来启动被监测的事件。光基因调控因子对特定波长的光作出反应，从而启动信号。当FRET供体激发波长与光遗传起始波长重叠时，光遗传调节器的激发会导致FRET传感器的杂散激活。
研究人员试图通过将荧光供体交换为生物荧光供体，制造BRET探针来缓解这些挑战。在这里，生物荧光供体不受其他荧光探针激活的影响，但仍然可以转移能量到荧光蛋白受体。NLuc具有明亮的发光特性，是一种优良的BRET供体。
细胞内钙离子传感器
杨等人(7)希望通过光遗传受体黑视素触发细胞内Ca++释放，需要短暂暴露在470nm蓝光下。为了避免与这种光基因工具的重叠，他们需要创建一个具有以下特性的钙传感器:
- 没有光致激发
- 高离子特异性
- 高灵敏度
- 简单的表达
- 给比率计数据
结果是一种叫做CalFlux VNT的融合蛋白。CalFlux VNT由Venus荧光蛋白、肌钙蛋白cca ++结合域和NanoLuc®荧光素酶组成。CalFlux VNT可对细胞内钙的变化做出反应，并可用于细胞和脑外植体事件的直接成像。这种结构可以通过Addgene(质粒#83926)。
Live-Cell电压传感器
Ingaki和同事(8)感兴趣的是使用光激活的、光遗传的定位器去极化或超极化膜。传统的FRET报告不能使用，因为所需的激发波长也会激活光遗传校正器。研究人员使用NanoLuc®荧光素酶将一个FRET报告基因转化为BRET报告基因，通过与膜插入的电压感应域(LOTUS V;通用感应电压的发光光学工具)。使用该传感器，膜去极化增加BRET信号，而超极化降低信号。作者还证明了LOTUS V在许多模型系统中都可以工作。这种结构可以通过Addgene(质粒#87127)。
将NanoLuc®荧光素酶与荧光蛋白配对，使得研究人员能够制造其他vwin德赢娱乐平台荧光素酶无法实现的创新工具。在这些工具中，nanoluc -荧光蛋白融合使NLuc的亮蓝色发光波长对细胞和在活的有机体内成像。NLuc还允许研究人员将FRET生物传感器转换成更多功能的BRET生物传感器，甚至可以与光遗传调节因子配对。Addgene提供了许多这样的工具，我们很高兴看到你如何在你的团队中利用它们!
非常感谢我们的客座博主Kyle Hooper。
前技术服务科学家Kyle Hooper博士也曾参与产品开发的研发工作，现在在Promega专门支持细胞分析产品。
参考文献
1.大厅,一下。et al。(2012)利用一种新型咪唑吡嗪酮底物从深海虾中工程荧光素酶报告。ACS化学杂志7, 1848 - 57。PubMedPMID: 22894855。公共医学中心PMCID: PMC3501149。
2.施密德,学生论文et al。CRISPaint允许使用连接酶-4依赖的机制进行模块化碱基特异性基因标记。自然通讯。7, 12338年。PubMedPMID:27465542。公共医学中心PMCID: PMC4974478。
3.肖布,F.Xet al。(2015) fluorophos - nanoluc BRET报告基因使敏感的体内光学成像和流式细胞术监测肿瘤发生。癌症Res。75, 5023 - 33所示。PubMedPMID: 26424696。公共医学中心PMCID: PMC4668208。
4.楚,J。等。(2016)一种明亮的蓝色可兴奋橙色荧光蛋白促进双发射显微镜和增强生物发光成像。生物科技本质》。34, 760 - 7所示。PubMedPMID: 27240196。公共医学中心PMCID: PMC4942401。
5.Susuki, K。et al。(2016)五种颜色的明亮发光蛋白实时多色生物成像。自然通讯。7, 13718年。PubMedPMID: 27966527。公共医学中心PMCID: PMC5171807。
6.Machleidt、T。et al。(2015) nanobret -一个新的分析蛋白质-蛋白质相互作用的BRET平台。ACS化学。医学杂志。10, 1797 - 804。PubMedPMID: 26006698。
7.杨,J。et al。(2016)耦合光遗传刺激与NanoLuc-based luminescence (BRET) Ca++传感。自然通讯。7, 13268年。PubMedPMID: 27786307。公共医学中心PMCID: PMC5476805。
8.Inagaki、S。et al。(2017)基因编码生物发光电压指示器用于广泛的生物成像。报告7, 42398年。PubMedPMID: 28205521。公共医学中心PMCID: PMC5322354。
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