你从Addgene中得到了编码你想要的蛋白质的质粒，把它转染到你的目标细胞中，现在怎么办?你如何知道你如此热衷研究的蛋白质是否在你的细胞中表达?免疫印迹法(Immunoblotting，简称western blot)是检测蛋白质是否存在的最简单的方法之一(Renart等人。，1979年,托宾等人，1979年,Burnett等人，1981年)。
western blotting的介绍
在西方，蛋白质是:
（1）以尺寸分开，
(2)转移到膜上，和
(3)检测使用抗体。
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| 图1：Western印迹过程概述。从蛋白质的混合物开始，它在凝胶中分离，转移到膜中，用抗体染色，并观察。 |
这个过程允许你在细胞或组织的复杂混合物中检测一个单一的，特定的蛋白质。蛋白质不仅可以用来检测蛋白质的存在或缺失，还可以确定蛋白质在系统中是上调还是下调，检测翻译后修饰，量化相对于标准的蛋白质水平，检测蛋白质的细胞位置，并可作为蛋白质相互作用研究的读数，如免疫沉淀和下拉分析。
西部分为两类，原生和变性。在一个本地西方，蛋白质的二级和三级结构保持完整，蛋白质通过基质通过电荷分离。在一个变性的西方，蛋白质变性到它的一级结构，并按大小分开，较小的分子在基质中移动得更快。在这篇博客中，我们主要关注改变西部片的性质。
按大小分开蛋白质混合物
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是西方的第一步。样品制备SDS-PAGE，测定蛋白质含量，并归一化，确保等效的装载。在还原剂(通常含有硫醇)的存在下煮沸，以裂解二硫键，使样品变性至原始氨基酸序列。将样品(每道一个样品)装入由交联聚合物丙烯酰胺组成的溶解凝胶的顶部。除了样品之外，在一个单独的通道中已知分子量的蛋白质标准可以帮助确定感兴趣的蛋白质的大小。施加在凝胶上的电流使带负电荷的蛋白质向凝胶底部带正电荷的方向移动，并按大小分开。
较小的蛋白质遇到丙烯酰胺基质中的耐抗性，并通过凝胶更快地迁移。为了更好的蛋白质分离，改变凝胶的丙烯酰胺含量。对于小蛋白质，使用更高百分比的丙烯酰胺以增加迁移性并改善分离。对于大蛋白质，减少丙烯酰胺的百分比。
为了进一步提高分辨率，在分辨凝胶顶部使用堆叠凝胶。堆叠凝胶通常具有不同的离子强度和低于拆分凝胶的pH和丙烯酰胺含量。在这些条件下，样品中的所有蛋白质以相同的速度迁移通过堆叠凝胶，并同时进入分离的凝胶，然后它们被尺寸分开。梯度凝胶是增强分辨率的另一个伟大选择。在该设置中，凝胶具有从上到下的丙烯酰胺含量的增加，允许在单个凝胶上分离具有宽尺寸范围的蛋白质混合。
将蛋白质固定在膜上
一旦分离，蛋白质被固定在膜上，通常由硝化纤维或聚偏二氟乙烯(PVDF)组成，这一步称为蛋白质转移。虽然硝基纤维和PVDF都是常用的材料，但由于其耐用性和高结合力，PVDF更受欢迎。此外，PVDF膜可以反复剥离一种抗体，并使用不同的抗体进行排斥，从而可以从单一western中评估多个目标。
蛋白质转移步骤有几个变化包括湿，半干燥和干燥，但所有遵循相同的一般原理，其中凝胶和膜“夹在一起”与印迹纸和电流一起施加，导致蛋白质迁移凝胶并附着在膜上。
在一个湿传输系统夹层被完全浸没在一个装满传递缓冲器的容器中，用来传导电流。湿转移过程是非常有效的转移范围广泛的蛋白质大小，但需要几个小时到一夜。
相比之下,一个半干转移只需要足够的缓冲液来饱和三明治，通常需要不到一个小时的时间。然而，使用这种方法大的蛋白质通常不能很好地转移。
最后,商用干印版系统在不需要任何转移缓冲液的情况下，在几分钟内有效地转移一系列蛋白质大小。然而，这些系统要求您购买昂贵的系统专用三明治。
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| 图2：蛋白质印迹干燥装置包括一堆滤纸，铜阳极/冰凝胶基质，印迹膜，凝胶，铜阴极/凝胶凝胶基质和滤纸。几乎就像一个真正的三明治！s'mores图片来自埃文·阿莫斯。 |
转移后，膜的一些区域仍然没有被蛋白质结合。这些未结合的区域是“粘性的”，有可能与用于染色的抗体非特异性结合。为了解决这个问题，膜在染色前在含有脱脂牛奶、牛血清白蛋白或其他蛋白质的缓冲液中孵育。细胞膜上的粘性区域会与缓冲液中的蛋白质结合，在染色过程中阻止细胞膜与抗体的结合。理想的阻断缓冲取决于所使用的抗体和标记，可能需要一些试验和错误(Yang et al.， 2012)。
选择一种抗体
一旦膜被堵塞，它就会被一种针对你感兴趣的蛋白质的一种抗体染色。但是你应该使用哪种抗体呢?你可能会从不同的供应商那里找到针对你感兴趣的蛋白质的几种不同的抗体选择，你甚至可能会发现编码Addgene抗体的质粒你可以自己制作。
要缩小搜索范围，首先要注意供应商网站上列出的已验证的应用程序，并选择一种已经过免疫印迹验证的抗体。不同的免疫检测方法检测不同状态的蛋白质。例如，在免疫沉淀(IP)中，抗体在其固有状态下与蛋白质相互作用，而western blot检测变性多肽链。可用于抗体结合的蛋白质区域，或表位，在蛋白质的自然状态和多肽链之间是不同的。因此，经过IP验证的抗体可能对西方人不起作用，反之亦然。
除了经过验证的应用程序外，请密切关注供应商网站上列出的控件。通常，供应商将证明其抗体与正确尺寸的蛋白质结合。许多供应商将显示抗体与瞬时过表达蛋白结合，然而，它们还应该证明抗体在生理相关水平下有效地结合内源性表达蛋白质。一些供应商还将在各种组织中测试它们的抗体，以证明蛋白质染色与组织中的预期表达模式相匹配。最近，击倒或敲除线已成为抗体验证中的黄金标准。这种验证水平确保抗体染色预期的目标。
一旦你选择了抗体，请仔细阅读数据表。供应商通常会包括工作浓度、阻塞缓冲液和潜伏期的建议。如果供应商包括引用该抗体的出版物，请考虑审查这些出版物的材料和方法部分。
最后，一定要验证所选择的抗体在你特定的实验环境中起作用(Pillai-Kastoori等人，2019)。供应商用于验证的组织或细胞系可能含有非预期的交叉反应蛋白。类似地，如果您改变了供应商使用的实验条件，那么可能会导致非特异性绑定。
只要可能，包括积极和消极的控制。阳性对照通常包括已知在生理相关水平表达该蛋白的细胞系或组织(不是过表达系统)，而阴性对照是那些不自然表达该蛋白或基因表达被敲除或敲除的细胞。如果您有兴趣制作您自己的敲除行进行验证，请查看本教程来自Stuart Orkin的和Daniel Bauer的实验室。
在二级抗体的帮助下，观察你想要的蛋白质
为了看到细胞膜上的蛋白质，抗体通常与一种酶结合，如辣根过氧化物酶(HRP)，该酶与特定底物反应时会发光。发出的光，或化学发光，在x射线胶片上或用特定的成像设备检测。在大多数情况下，结合目标蛋白的一抗是不被标记的。相反，一种偶联的种特异性二抗被用来可视化蛋白质。在这种设置中，多个二抗分子结合一抗并放大检测信号。
western blot分析
一旦发现，是时候分析你感兴趣的蛋白质了。分析通常从确认与蛋白质标准相比较的蛋白质的预期大小开始。
蛋白质的丰度
此外，条带的厚度提供了关于样品中蛋白质的相对丰度的信息。蛋白质越多，条带越厚，而蛋白质越少，条带越薄。然而，需要注意的是，在评估蛋白质丰度或横向比较样本时，必须包含一个加载控制。
对于典型的载荷控制，用抗体探测膜，其检测普遍表达蛋白质，例如肌动蛋白。肌动蛋白水平应在凝胶上的所有样品中一致，并且应该观察到所有样品中存在一致尺寸和密度的带。不均匀样品加载或不完全蛋白质转移导致负载控制的不一致水平。在这些情况下，西方应该重复。
最后，虽然西方人是测量蛋白质丰度的有用方法，但他们提供了定性的测量。如果你需要精确的蛋白质定量，可以考虑使用其他方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA) (Aydin等人，2015)。
转录后修饰
除了蛋白质丰度外，蛋白质蛋白质还能检测蛋白质翻译后修饰的变化，如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。例如，为了测试蛋白质是否在特定的实验条件下被磷酸化，你可以在治疗前后寻找蛋白质带的轻微大小变化。
对一些细胞分析来说，蛋白质图谱也是一种有用的解读。它们可以确定免疫沉淀后的蛋白质相互作用，是亚细胞分离(从不同的细胞室如线粒体、细胞质和细胞核分离蛋白质的过程)的常见读数。
我们希望这篇博客能让你对western blot有一个很好的了解。当计划西药时，要注意包括适当的阳性和阴性对照，选择针对你的应用验证的抗体，并在你的特定系统中测试抗体。如果你觉得这个博客有帮助，一定要去看看Addgene的博客有关其他抗体主题的概览。
资源和引用
参考文献
Aydin S(2015)简要介绍了ELISA的历史、原理和类型，以及我们使用ELISA进行肽/蛋白分析的实验室经验。肽72:4-15。https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012
Burnette Wn（1981）“Western印迹”：用抗体和放射性蛋白蛋白A的抗体硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的电泳转移与未改性的硝酸纤维素和射线照相检测。分析生物化学112：195-203。https://doi.org/10.1016/0003 - 2697 (81) 90281 - 5
Pillai-Kastoori L, Heaton S, Shiflett SD, Roberts AC, Solache A, Schutz-Geschwender AR(2019)免疫印迹抗体验证:由用户，为用户。生物化学杂志295:926-939。https://doi.org/10.1074/jbc.ra119.010472
Renart J，Reiser J，Stark Gr（1979）将蛋白质从凝胶转移到二氮杂苄氧基甲基纸和抗血清检测：一种研究抗体特异性和抗原结构的方法。国家科学院的诉讼程序76：3116-3120。https://doi.org/10.1073/pnas.76.7.3116
蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶到硝基纤维素薄片的电泳转移:程序和一些应用。国家科学院学报76:4350-4354。https://doi.org/10.1073/pnas.76.9.4350
杨鹏程(2012)免疫印迹技术的研究与应用。North Am J Med Sci 4:429。https://doi.org/10.4103/1947-2714.100998
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