我们中的许多人在这一事实中享有舒适，但它通常不是数量，但质量真的很重要。好吧，事实证明，使用AAV并非如此。当涉及感染细胞时，滴度，使用的病毒量真的很重要。（* PSST *，质量肯定也很重要）。
与细胞接触
虽然个体AAV粒子感染细胞的能力取决于其衣壳结构和它感染的细胞，使这些颗粒感染细胞也非常棘手依赖性。为了使AAV颗粒感染细胞，必须与该细胞进行身体接触。由于每个单元上存在有限量的表面积，因此获得更多AAV与电池接触的方式是增加AAV浓度。
在该流程图中，您可以看到AAV粒子的DWWINDLING比例，使其通过细胞的每一部分到能够表达其基因货物的核心。
底线是很多AAV颗粒需要将一些好的颗粒进入细胞以产生表达。滴度越高，越好。
AAV运输和转基因表达
很明显，我们需要高滴度，因为细胞与任何单独的AAV颗粒之间的接触是罕见的。但只需进入细胞可能并不总是足够的，因此将需要更高的滴度。例如，逆行AAV.被传送到细胞的轴突。虽然尚未完全理解这种功能的机制，但我们可以想象这种运输可能不是效率100％。因此，已经进入电池的少数AaV颗粒现在必须通过电池向轴轴行进，并且可能散布在甚至更大的区域上，因此需要更高的逆行AAV滴度以成功转导。
在另一个实例中，显示了蒽曲面AAV的神经元基因表达，用较低的滴度急剧下降。正如您在图2中看到的那样，来自5X10的表达式11.滴度基本不存在，因为没有足够的病毒来产生任何可观察表达。将这个滴度加倍到1012.导致大约200个细胞中的表达。将滴度增加到1013.导致表达式大致6倍[3，图2]。注意表达如何随着滴度的增加呈指数级增长。这意味着一旦你下降到每种细胞的某种病毒颗粒的某个（非常高）的阈值，您可能无法检测靶细胞中的AAV介导的基因表达。
实践考虑因素
如果您有高质量的AAV，您可以通过集中病毒来解决低滴度问题。看我们集中AAV协议（步骤10）有关如何执行此操作的说明。集中病毒将允许您在解决方案中添加更多病毒粒子，同时仍然使用与您的实验设置兼容的卷。
一些实验需要更高的基因表达，因此比其他实验更高。通常需要高滴度来可视化荧光蛋白的表达，例如，由于许多病毒颗粒必须感染细胞以实现蛋白质的可见表达。vwin德赢娱乐平台然而，受体的表达可能不需要高度才能在实验中实现可观察信号，因此在用AAV输送受体构造时，滴度可能不需要高。在通道流血素的情况下，转导电池需要较少的通道蛋白质响应于获得良好荧光信号所需的荧光蛋白变响光。vwin德赢娱乐平台在寻找有效基因表达时，可能没有必要将这种类型的载体集中到这种高滴度。
你如何首先实现高滴度？
已知一些AAV难以在高滴度中产生。这些包括AAV2，已知将其粘附到细胞内部，导致较少的颗粒释放到悬浮液中并降低可以从周围介质收获的病毒颗粒的数量。
尽管如此，您可以通过各种方式优化AAV生产。我们列出了一些简单的步骤，您可以在下面采取，但您应该阅读我们的AAV生产协议有关其他最佳实践。
- 让您的细胞快乐 - 确保您的细胞尽可能健康，以便为产生病毒颗粒的艰巨过程来制备它们。
- 限制管转移 - 您的病毒颗粒必须粘在管的机会越少，您将拥有的较高滴度。当可能时，使用低绑定或硅化管来存储样品，因为病毒颗粒更难以粘附在这些管中。
- 冲洗过滤器 - 使用浓度过滤器柱时，请务必用周围溶液冲洗滤膜的表面，以确保过量的病毒颗粒不保持粘附到膜上。
- 稀释时要小心 - 如果您最终将您的AAV集中在您所需的滴度上方并希望稀释它，请在谨慎时误差，然后将缓冲区添加回解决方案时。添加比例更少的缓冲区，以实现精确的所需集中，以避免过度稀释，并务必在稀释以确认后重复滴定。
Luke Makana Hanley是Addgene的研究团队理工科技，致力于改善AAV生产的方法。
参考
1。Clark，K. Reed。“最近重组腺相关病毒载体生产的进展。”肾中国际61.1（2002）：S9-S15。PubMed.PMID：11841606。
2. Schultz Br，张伯伦js。重组腺相关病毒转导和整合。分子疗法：美国基因治疗学会杂志。2008; 16（7）：1189-1199。DOI：10.1038 / MT.2008.103。PubMed.PMID：18500252。pmed中央PMCID：PMC2574934。
3.Zingg，Brian等。“AAV介导的前突触突触标记：映射皮质胶质胶凝输入定义的神经途径，用于防御行为。”神经元93.1（2017）：33-47。PubMed.PMID：27989459。pmed中央PMCID：PMC5538794。
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