我实验室的选择的传染媒介是AAV，几乎每个需要AAV的实验。在加入我的实验之前，我从未与AAV一起工作，所以自然地我必须为我的第一个实验包装一些病毒。这有点令人恐惧，但我有我的实验室的协议和一些伟大的同事帮助我。即使使用这些工具，我发现自己也将Aav生产技巧写成了我协议的边缘。虽然这些提示对实验并不重要，但它们绝对让我的生活更轻松！在这篇文章中，我会分享一些AAV生产,净化， 和滴定法同时总结了包装AAV所需的基本步骤和分析。
AAV生产
概述:包装AAV的第一步是用AAV包装质粒转染HEK293细胞。细胞需要三种不同的质粒来产生AAV：1）Repcap质粒，其提供AAV复制（Rep）和衣壳（帽）基因。AAV复制使用宿主的聚合酶，但需要Rep蛋白以将双链中间体加工成单链基因组，然后包装成Aav的蛋白质壳或衣壳;2)表达腺病毒基因介导AAV病毒复制的pHelper质粒;3)转移质粒，它编码一种被包装到病毒中的转基因。转染后2 - 5天，收集并纯化含有aav的细胞和培养基。总的来说，这一过程需要4-7天，还不包括HEK293细胞扩增所需的时间。检查Addgene AAV生产协议为更多的细节。
专业提示
- 我不打算撒谎，AAV转移质粒是一种痛苦的工作。这些质粒含有itr，这些itr是AAV适当包装所必需的，但也形成了容易从转移质粒上删除的二级结构。好消息是，有一些简单的方法可以解决这个问题。一种方法是将你的AAV转移质粒在30°C而不是37°C下进行多重细菌培养，然后用a筛选ITR重组SmaI或XmaI限制酶消化（ITRS包含SMAI和XMAI限制性位点）。另一种方法是将AAV转移质粒转化为细菌菌株，如内稳定。稳定的感受态细胞缺乏RecA，这是一种帮助类似itr的复制区域的同源重组的蛋白质。限制摘要筛选ITR删除仍然是必要的。
- 为了节省时间和金钱，我喜欢Miniprep 5毫升我的AAV转移质粒培养，然后用SMAI消化筛选。我将细菌颗粒冻结为剩余的培养物，后来的Maxiprep只有完整ITR的培养物。
- 我使用类似于这个计划我的AAV包装PEI转染。它节省了我的时间，帮助我弄清楚我是否有足够的质粒来完成我的实验。
- AAV通常是我实验的限制试剂，所以我总是制造出比我认为需要的更多的AAV。与慢病毒不同的是,AAV需要更多的病毒颗粒为了高效的基因转移。我认为有一点额外的AAV比产生更多的病毒要好因为我没有足够的AAV。
- 与Addgene AAV生产协议相比，我采取了一种懒惰的方法来收获我的AAV。我跳过HEK293细胞培养上清液的PEG沉淀，因为准备40％PEG溶液的耗时耗时。PEG在加热的搅拌板上需要几个小时以溶解并且需要监测，以便解决方案不会太热，因为然后钉将分为两个阶段。如果发生这种情况，可以冷却解决方案，并且两个相混合在一起。最后，需要通过过滤灭菌的PEG解决方案，这需要时间，因为溶液是粘性的，或通过高压灭菌，这也需要时间。我选择只收获细胞颗粒，而不是投资所有这些努力。如果我使用PEG降水，但对于我的实验，我的收益率会更高，但是，我单独从细胞颗粒中获得足够的病毒。如果产量很重要，或者如果您使用的AAV血清型的病毒颗粒主要在培养基中发现，您应该考虑进行PEG降水。
- 我用这个来裂解细胞，而不是用声波来裂解细胞AAV裂解缓冲并在95％乙醇和干冰浴中冻结/解冻四次，以释放来自细胞的病毒颗粒。然后立即用碘烷醇纯化立即用苯并酶处理细胞裂解物。这种方法给了我一些灵活性，因为在净化AAV之前，我可以在-80°C下将细胞裂解物存放在-80°C上长达6个月（Choi等人）。
碘二醇梯度超滤法纯化AAV
概述:Iodixanol梯度超速离心使用不同浓度的碘司醇梯度将污染物分离出不纯的AAV制剂。仔细分层15％，25％，40％和60％碘烷醇溶液，然后覆盖在AAV生产过程中产生的病毒悬浮液。在超速离心之后，收集含AAV的40％级分，并交换缓冲液以除去碘烷醇并浓缩纯化的病毒。该过程可以在漫长的一天内完成，或者病毒可以在4°C和第二天交换缓冲器。参考AAV Iodixanol梯度超速离心协议为更多的细节。
专业提示
- 看这个AAV净化视频!当我第一次进行碘二醇梯度提纯时，它还不存在，但我希望它存在。该视频简要概述了碘沙醇的工作原理，展示了如何创建碘沙醇梯度层，并有一些伟大的指针，同时帮助您掌握碘沙醇AAV纯化。
- 如果你是创建梯度的新手，在做第一次净化之前练习制作碘二醇层。这帮助我获得了碘二醇溶液分层的感觉，让我再次检查碘二醇梯度溶液是否准备正确。
- 当纯化后的病毒和缓冲液交换后的病毒进行配位时，记得做一到两个小的配位以用于qPCR滴度。这有助于避免病毒的多次冻结/解冻。
qPCR法测定AAV
概述:QPCR的AAV滴定量量化了AAV PREP中存在的含基因组病毒颗粒的数量。首先消化AAV样品以除去从AAV生产过程中携带的任何残留的AAV质粒。可以使用SYBR绿色技术或TAQMAN引物/探针组，并通过与AAV标准曲线进行比较来量化样品，其由含ITR的质粒产生。整个过程需要3小时才能完成：1小时的动手时间和2小时QPCR运行和数据分析。请参阅这一点添加基因AAV的qPCR滴定法为更多的细节。
专业技巧
- 计算AAV滴度时，请记住算用于DNASEI消化的样本的稀释。
- 使用良好的无菌技术处理您的AAV质粒标准和AAV转移质粒。很容易用质粒污染工作空间，但我不知道这一点……一个无模板对照(NTC)应该总是包括在内。
- 虽然QPCR产生的物理滴度是有用的，但是，我测试几种不同浓度的病毒，或多种感染（沼泽），以确定感兴趣的我的细胞的AAV的最佳剂量。每批AAV都需要自己的MOI优化来算用于批量到批量变化。看看这篇文章了解更多关于降低AAV滴度的不同方法。
你有什么AAV制作技巧吗?请在下面的评论中分享!
特别感谢Dan Stone博士和Harshana de Silva Meaixge在Fred Hutchinson Cancer Center教授我关于AAV的生产和净化！
参考文献
1.aunhammer, C.， Haase, M.， Muether, N.， Hausl, M.A.， Rauschhuber, C.T.， Huber, I.， Nitschko, h.m.， Busch, U.， Sing, a.s.， Ehrhardt, A.， & Baiker, A.(2012)。通用实时荧光定量PCR用于检测和定量腺相关病毒血清型2衍生的倒置末端重复序列人类基因治疗方法23, 18-28。PubMedPMID:22428977。
2.Choi, v.w.， Asokan, A.， Haberman, r.a.， & Samulski, R.J.(2007)。生产体外和体内使用的重组腺相关病毒载体。vwin668分子生物学的现行协议，第16章16.25、单位。PubMedPMID:18265393。
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