第一次使用CRISPR的用户提示(来自第一次使用CRISPR的用户)

由Leila Haery

莱拉Haery

我们都知道,在实验室里经常有一些小技巧是实验必不可少的,但没有人谈论。经过几个月的排除,那些没有告诉你重要事情的人怀疑地问,“你真的没有加3微升5毫米八角茴香?”这是我在开始制作我的第一部作品时所期待的CRISPR / Cas9基因编辑。我想让基因失活BRAF(一种涉及多种人类癌症的激酶)在A549细胞(一种人类肺癌细胞系)中,只携带通过Addgene的病毒服务和科学文章的方法部分获得的病毒。令我高兴的是,我不仅能够在没有任何试剂级濒危的火星菊苣根的情况下进行编辑,而且考虑到这是大海捞针的目标,这是令人惊讶的简单。这是真的,我CRISPRed。在这篇文章中,我将总结基本步骤和分析,并给出我认为是执行和分析使用Addgene的慢病毒CRISPR工具的每个步骤的主要提示。

CRISPR / CAS9基因编辑过程的示意图概述

Cas9交付

Cas9 A549 Pool表达式概述在任何编辑开始之前,我们需要A549细胞来表达Cas9。在这些特定的实验中,我们通过Cas9慢病毒载体转导生成了稳定表达Cas9的A549细胞,lentiCas9-Blast(52962 - lv, F图1)。一些细胞然后习惯通过限制稀释产生单克隆细胞系。其余的细胞被冷冻。

专业人员:

exclamation.jpg__65x63_q85_subsampling-2_upscale.png1.这是关于MOI的全部。回想起来,我考虑到A549细胞相对容易地传播的Cas9 MOI太高的方式。我最终有太多的CAS9集成度,我的稳定细胞池具有众多可变的CAS9表达式(图1)。这是一个问题,因为Cas9表达会影响增长率,因此我的池池会随着时间的推移而发展,这对于屏幕的可重复性和坏消息是坏消息。由于addgene病毒设置在特定滴度处,因此可以更好地规划转机并使用一系列合理的沼泽。

2.创建单克隆CAS9表达细胞系。特别是如果你正在进行屏幕。我制造了一些单克隆线(图2),并且在变量Cas9-表达式跨越不同的细胞时感到惊讶(图3)。

Cas9单克隆表达

3.在制作单克隆药物方面:我以前从未这样做过,第一次成功可能是因为我使用了一个健壮的细胞系。如果你的细胞是敏感的,可能更难让它们生长出来。唯一的缺点是,单个细胞的生长需要数周的时间。然而,由于细胞生长缓慢,没有太多的维护。在96孔培养皿中发现单个菌落也很有趣。我的协议和许多其他技巧可以找到在这里

变量Cas9 Expression Comic.png

检查Cas9表达式

概述:通过Western Blotting(图2,池),我知道细胞表达CAS9,但我不知道什么样的表达水平是最有效的基因编辑。编码GFP加上靶向GFP的GFP的病毒(pXPR_011,59702 - lv)用于检测我稳定的A549细胞池中Cas9的活性。利用该病毒,Cas9的活性在病毒传递的GFP gRNA的引导下,可以编辑掉病毒传递的GFP基因。因此,没有Cas9的细胞应该是绿色的,有功能Cas9的细胞应该是绿色的。请注意,不会对种群中的所有细胞进行统一编辑,因此尽管Cas9处于活性状态,一些细胞仍会显示绿色(见提示2)。

专业人员

exclamation.jpg__65x63_q85_subsampling-2_upscale.png1.使用此测定量化Cas9活动,您真的需要使用FACS(就像他们在原始出版物中所做的那样)。我以为我可以用荧光显微镜看到GFP表达,但GFP表达如此低(即使在缺乏CAS9的转导野生型A549个细胞中,也应该表达GFP),我无法获得良好的形象。您可能也可能对针对GFP表达的Western Blot,但我没有。

2.在最初的研究中,他们发现大约20%的cas9表达细胞中有GFP表达。所以,即使当Cas9有效编辑时,也不要期望100%的基因敲除群体。

BRAF GRNA交付

概述:在实践中,您将选择“编辑最有效”的CAS9线,以介绍GRNA,但我只是随机选择了一个稳定的池。含有BRAF GRNA的病毒(BRDN0000561167和BRDN0001146266)(76479 - lv76480 - lv)或控制GFP gRNA (BRDN0000561167)(80034 - lv通过原始出版物的推荐,单独用于在0.3的MOI下转导的Cas9-A549细胞稳定的Cas9-A549细胞库。

Pro-Tip:

exclamation.jpg__65x63_q85_subsampling-2_upscale.png1.使用多个gRNAs靶向你基因的不同区域。我使用现有的BRAF gRNA病毒,但你可以找到一个列表验证gRNA质粒在我们的网站上。用多个gRNAs靶向基因的不同区域有几个原因,但最重要的是,通过比较多个gRNAs的表型,可以避免潜在的脱靶现象。如果基因发生了你不知道的奇怪突变(这可能会影响gRNA结合的能力),瞄准基因的不同区域也是有用的。

使用测量师测定验证基因组编辑

页面测量员Assay.png概述:我使用Surveyor assay在我的特定gRNAs瞄准的BRAF位点上寻找基因组编辑(图4)。该检测最困难的部分是设计基因组DNA编辑侧边的引物,并对基因组DNA进行PCR。测量员化验本身比较容易。

测量师测定的基础是测量师核酸酶在巴西普通错配的下分离双链DNA(DSDNA)。为了使用该工具来检测BRAF基因编辑,只需从编辑的细胞(PCR产物应含有编辑BRAF序列)的BCR扩增BRAF基因座,并且PCR-扩增来自对照细胞的BRAF基因座(PCR产物应含有PCR产物野生型BRAF序列)。然后,将PCR产物混合并使用温度变性并重新致力于DSDNA。复归后,您将产生与从编辑细胞的一股的DNA双链链,从对照细胞中含有一股股骨,这应该在编辑部位含有基座不匹配。使用测量仪核酸酶然后通过凝胶电泳,通过DNA切割产品的存在表示这些不匹配。

428个基点乐队的外观显示编辑在BRAF-gRNA BRAF基因转导的细胞,在细胞转导并没有这样的编辑控制GFP-gRNA(图4、5)。这种凝胶曝光过度时,我甚至可以看到85个基点产品底部的凝胶在BRAF gRNA-transduced样本(数据未显示)。

专业人员:

exclamation.jpg__65x63_q85_subsampling-2_upscale.png1.针对基因组DNA的引物进行扩增,以扩增GRNA靶标挑战,因为您受到人类基因组序列的限制。我用过UCSC基因组浏览器和Primer3设计扩增500- 600bp产物的引物。我设计的引物(上面列出的)工作良好,我得到清晰的条带使用上述条件。

琼脂糖凝胶测量师Assay.png2.设计底漆,使消化遗址不在PCR产品的中间。如果不匹配在PCR产品的中间,您将期待两个同样大小的消化产品(将在凝胶上迁移)而不是两个不同的消化产品(这可能更容易想象和识别)。如果您需要/想要将消化网站放入PCR产品的中间,您仍然能够识别切割产品。

3.测量工具有很多给初次用户的好建议,我都遵循了。如果你以前从未使用过这种方法,可以考虑以下建议,包括:

    • 在用测量者核酸酶消化DNA双工之前,保存一些双工并作为未消化的对照运行。有时PCR产物看起来像涂抹,所以有一个未消化的对照可以帮助区分涂抹和微弱的消化产物。此外,根据细胞中基因编辑的程度和测量者消化反应的效率,消化产物可能是有限的和微弱的,所以有尽可能多的控制来确认你的结果是有用的。(图5)。消化产物(图4,泳道0.3% 3.0,图5,泳道2)很模糊,所以与未消化的对照(图4,泳道0,图5,泳道1)比较,可以确定这是一个真正的消化产物,而不是另一个PCR产物。

4.在优化反应并确认条带的存在之后,你可以使用另一种凝胶来突出重要的结果(例如,如果你需要用数据做一个数字)。用丙烯酰胺代替琼脂糖可以得到更清晰的条带。我比较了两个gRNA转导的moi,看看是否对编辑效率有任何影响,结果没有(图4)。

5.理论上,你可以使用密度分析来定量凝胶上条带的强度,并得到在群体中有编辑的细胞的百分比。我没有这么做,但要做到这一点,你需要一个非常好的凝胶图像。如果你在分析短的DNA片段,用PAGE代替琼脂糖来得到更清晰的条带。

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结论

总的来说,通过基因敲除来制造人类细胞系是很简单的,也是基因组工程取得进展的证明。相比之下,2007年,该公司用了大约3个月的时间,用基于同源重组(Rago等人,2007)。使用CRISPR,我能够在大约1个月的时间内敲除人类癌细胞系中的BRAF,我要说这是非常惊人的。尽管研究机会不断变化,但这是一个令人兴奋的实验室时代。基于现有技术的力量,以及共享信息和董事是多么迅速和容易,想到这一点是令人兴奋的你是谁,你可能很快就能进行新的科学观察。


参考文献

1.人类体细胞的基因敲除和敲除。自然的协议2007;2(11): 2734 - 46所示。PubMed.PMID: 18007609

Addgene材料

1.lentiCas9-Blast (质粒#52962)是来自张张的一份礼物,并在改进的载体和基因组图书馆中描述了Crispr筛查。Sanjana Ne,Shalem O,张F. NAT方法。2014年8月11日11(8):783-4。DOI:10.1038 / nmeth.3047。10.1038 / nmeth.3047。PubMed.PMID: 25075903。公共医学中心PMCID: PMC4486245

2.pXPR_011 (质粒# 59702)是来自John Doech&David Root的礼物,并在高效SGRNA的合理设计中描述了CRISPR-CAS9介导的基因失活。Doiong Jg,Hartenian E,Graham DB,Tothova Z,Hegde M,Smith I,Sullender M,Ebert BL,Xavier RJ,Root de。NAT BIOTECHNOL。2014年9月3. DOI:10.1038 / NBT.3026。10.1038 / NBT.3026 PUBMEDPMID:25184501。公共医学中心PMCID:PMC4262738.

3.EGFP gRNA (BRDN0000561167) (质粒# 80034)和BRAF gRNAs (BRDN0001145345和BRDN0001146266) (质粒# 76479# 76480)是来自John Doench和David Root的礼物,并在优化sgRNA设计中描述,以最大限度地发挥CRISPR-Cas9的活性和最小化脱靶效应。Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, Smith I, Tothova Z, Wilen C, Orchard R, Virgin HW, Listgarten J, Root DE. Nat Biotechnol. 2016年1月18日。doi: 10.1038 / nbt.3437。PubMed.PMID: 26780180。公共医学中心PMCID: PMC4744125

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