拟南芥转型提示

客人的博客

这篇文章由劳拉·李贡献,斯坦福大学的研究生。

拟南芥是一种奇妙的模式生物,原因有很多,不仅仅是它容易转化。产生转基因的动机有很多拟南芥,从研究生物植物中基因和蛋白质的转录和翻译动态,以补充突变表型。拟南芥适用于花滴水或浸渍变换方法。此方法的一般步骤包括:

  • 克隆和转化质粒到细菌农杆菌突厥 -一种植物致病性物种,可稳定地将转移DNA(TDNA)与IT攻击植物的基因组
  • 种植转化农杆菌培养物
  • 将你的植物的花浸入农杆菌培养中,让tDNA插入到植物的种系中
  • 选择有tDNA插入的种子(通常通过种子在含抗生素的培养基上生长)

在自然界中发生类似的过程;农杆菌属TDNA插入可能会沉淀甘薯的驯化(Kyndt等等。,2015年)!这听起来很简单,它几乎是,但有一些技巧可以用来获得最佳的变换效率。从转换之日起6-8周只需要6-8周,以便在手中进行分析的转基因,因此在第一次获得此过程非常重要。我会在这里铺设一些指导方针。详细的转型协议,以及生长的协议拟南芥亦可(Weigel和Glazebrook,2002年)。

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选择表达式系统

选择合适的表达载体是产生转基因拟南芥的第一步。有一堆很棒的选择,但这里有几个我的最爱。来自中川刚实验室的质粒是二进制网关向量并且可用于启动子交换和产生N和C末端标记的融合蛋白,用荧光(YFP,GFP,CFP,RFP等)或亲和标签(HA,FLAG)。还有各种植物选择标记(Basta,Hygromycin,Kananamycin,Tunicamycin)(中川昭一等等。,2007年)。或者,如果您更喜欢金门组件,有一系列来自迪尼实验室的质粒另外允许基于种子中的RFP的表达进行视觉选择转化体(emami,yee和Dinneny,2013)。

制备转型植物

无论你转化成什么植物,都将是你的T0一代。当这些植物开始开花时,它们就准备好转变了。重要的是在开花后不久进行转化。如果你的植物在你的结构准备好转化之前就开始开花了,你可以剪掉茎基部附近的主花序(植物开花的部分)。这为你争取了几天的时间,直到新的花序开始生长。这也将增加花序的总数,这可能提高转化效率。如果你看到许多成熟的角质层(种子荚),你的植株可能太老了,不能转化。这种转变仍然可行,但效率会很低。

小贴士:

  • 使用健康植物:您的植物应显示不应力的迹象,如花青素生产,或疾病,如真菌生长。健康的植物产生很多种子。更多种子意味着更多的机会回收转化体。
  • 使用幼苗:如果你在早期转化,你的植株在花暴露后仍有足够的时间结出种子农杆菌属。更多种子意味着更多的机会回收转化体。
  • 使用大量植物:很多植物都会产生大量种子。我通常使用每个构造的8-10株植物。更多种子意味着更多的机会回收转化体。
  • 在转化之前去除成熟的单片机:在转化之前成熟的单片机恰好是您知道不会留下您的转基因的种子。您可以选择删除它们以减少池中的非转换种子的数量,您将从以后选择。

拟南芥转型过程

这个过程本身很简单。当你的农业细菌培养准备好了,将它们旋转下来,并在转化培养基中重新悬浮它们。如果你在浸泡你的植物,把培养物放在一个足够宽的容器里,以浸泡你的植物的花。50毫升的猎鹰管或塑料称量船都是很好的选择,这取决于你选择的文化量。你会得到农杆菌属全部穿过手套,所以如果您一次转换多于一个结构,请务必改变构造之间的手套。

Arabidopsis Tranformation.

用于详细协议,卷,旋转速度,食谱和农杆菌属菌株看到Weigel和Glazebrook,2002年

小贴士:

  • 做A.殖民地PCR.在你的农杆菌上:获得一个转化体需要很长时间。确保您生长的农杆菌培养肯定含有您的质粒。
  • 成长很多农杆菌属:您将植物暴露的农作用率越多,您就越有可能获得变革者。我喜欢旋转100毫升培养物并重悬于25毫升的转化培养基中农杆菌属拉紧。此外,转换过程可能会有点凌乱,因此您希望确保有足够的音量来浸入所有植物。
  • 确保你的农杆菌属文化没有过度饱和:农杆菌属需要活着感染你的植物。如果您的培养物在固定阶段孵育过长,则文化中的细胞将不再可行。这需要的时间取决于您使用的培养量,以及您是否接种来自冻结的股票或从LB板的殖民地。在我手中,5毫升从板上的殖民地接种的5毫升起动培养物将在18-24小时内达到最佳密度。然后将0.5ml这种起始培养物加入100mL新鲜培养基,然后在另外24小时内随时使用。剩余的起动培养物可用于菌落PCR和甘油股。
  • 浸渍/滴灌厂多次:浸泡植物,让他们恢复一周,然后再次浸。这不会伤害它们,它将增加TDNA集成的机会。

选择拟南芥转化株

一旦你的种子从你的T0植物干燥,是时候选择转化。从每个转化中选择多个T1植株是非常重要的。我想至少要有五个。您无法控制发生了多少插入。有太多的插入会导致过表达产生的工件,并且这样的构造很可能会在后续的代中被停用。你将知道如果你获得了一个单插入的转化子,因为它将分离3:1在T2代。您也无法控制将构造插入的位置。如果你的插入发生在一个编码区域,它可能会导致意想不到的表型。对于大多数表型分析来说,在T2代开始工作是合适的。选择过程本身会影响抗性植物的生长,所以你需要知道在没有选择的情况下插入的效果。

对于抗生素选择的方案,请退房哈里森等等。,2006年

小贴士:

  • 在选择期间不太密集地铺板种子:这将增加非转化体的背景生长,并使真正的转化体更加困难。
  • 不要让你的植物在选择盘中停留太久:即使是抗性植物最终也会受到选择的影响。
  • 基因型推定T1转化体:当您的T1在土壤上并从选择的应力中恢复时,可以夹住叶子并提取基因组DNA进行基因分型。这不会伤害您的植物,而T1的基因型比T2更容易。您的转基因不应在T1中隔离,但它可能会在T2中。

头像劳拉·李是斯坦福大学的一名研究生。她研究气孔系中细胞命运的维持,并在此过程中培育了无数转基因植物。

参考

1. emami,s.,yee,m。和dinneny,J. R.(2013)'植物合成生物学的强大金门土壤载体家族',植物科学的边疆,4. DOI:10.3389 / FPLS.2013.00339。PubMed.PMID:24032037。pmed中央PMCID:PMC3759027

2 s·J·哈里森等等。(2006)“鉴定拟拟合拟南芥籽幼苗”的快速和稳健的方法,如花卉DIP转换,植物方法。生物化中央,2(1),p。19. DOI:10.1186 / 1746-4811-2-19。PubMed.PMID: 17087829。pmed中央PMCID:PMC1636043

3. Kyndt,T.等等。(2015)'培养的甘薯基因组含有特拉基杆菌T-DNA,具有表达基因:天然转基因食物作物的一个例子。',美国国家科学院的诉讼程序。国家科学院,112(18),PP。5844-9。DOI:10.1073 / PNA.1419685112。PubMed.PMID:25902487。pmed中央PMCID: PMC4426443

4. Nakagawa,T.等等。(2007)“改进的网关二进制向量:在植物转基因分析中创建融合构建的高性能向量”,生物科学,生物技术和生物化学,71(8),pp。2095-2100。DOI:10.1271 / BBB.70216。PubMed.PMID:17690442

5. Weigel,D.和Glazebrook,J.(2002)拟南芥:实验室手册。冷泉港实验室新闻。可用于:https://books.google.at/books/about/Arabidopsis.html?id=IfZAMNPWVk4C&redir_esc=y(发布日期:2018年9月21日)

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话题:植物生物学分子生物学协议和提示质粒

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