在实验中使用FRET的提示

由Benoit Giquel

Benoit Giquel

我第一次听说幸运期间的俱乐部期间,我的吉他手大脑会自动考虑吉他脖子上发现的凸起元素......对你会说的生物学家来说并不真正有用。学生当然谈论现在众所周知FRET,AKA荧光(FÖRSTER)共振能量转移,允许检测分子相互作用,修改或解离的技术原位。自90年代中期以来使用,这种技术彻底改变了我们逮捕分子复合物的方式,仍然是一个非常有用的工具。

像吉他英雄(我不是),FRER喜欢玩“活着”。实际上,FRET是使用显微镜使活细胞中单分子相互作用测量的第一技术之一。历史上,通过间接观察分子相互作用通常使用探针具有靶向几种分子的探针。通过类比,它就像指出大学大厅的一群学生,但不知道这些学生是否相互了解或互动。FRET降低了我们对分子相互作用的看法的规模。

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什么是烦躁?

在他们的杰西博2003年的论文, Sekar和Periasamy将FRET定义为“一种依赖距离的物理过程,通过分子间远程偶极-偶极耦合,能量以非辐射方式从一个激发态分子荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体)”。受体荧光团的发射可以用显微镜技术来测量。FRET测量灵敏度使其适合于研究活细胞内的相互作用。通过将荧光团与蛋白质结合,这项技术的先驱者能够直接检测活细胞中的蛋白质/蛋白质相互作用。从那时起,FRET也被用于测量构象变化、解理活性FRET-based生物传感器, 和DNA和蛋白质之间的相互作用。在理论上,FRET是一种简单的技术,但遵循一些简单的规则来避免普通陷阱并以最佳方式使用它是非常重要的。

FRET如何运作的原理图。

影响褶皱的参数是什么?

当使用的两个荧光团很接近时,就会发生FRET。因此,两种荧光团之间的距离以及它们彼此的方向可以影响褶皱。当涉及研究两种蛋白质之间未知的相互作用时,这些参数难以克服,但在分析来自FRET实验的数据时必须考虑它们。您可能必须设计几种不同的构造,以找到一个可用于学习目的的结构。设计时这些参数不太重要生物传感器,因为两个荧光团之间的距离及其空间方向是固定的。

供体的量子产额(每吸收一个光子发射的光子数)和消光系数的受体(将吸收光的数量连接在给定波长,溶液中荧光团的浓度)是两种可能影响FRET效率的附加参数。通过选择互补项,可以克服这些问题一双荧光团。为了最大化FRET信号,您应该选择最高量子产量供体,最高的吸收受体和荧光团,其光谱中具有显着重叠的荧光团。该对CFP-YFP是第一个用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用的待研究,并且已经使用了几对 - 包括:mcerulean./m,mcerulean./琥珀色,mcerulean./SYFP2A,mTurquoise/m和其他人。CFP-YFP仍然是衡量FRET最好和最常用的组合之一。

下表列出的质粒可以用来创建您所选择的荧光融合蛋白与您感兴趣的基因:

质粒
颜色
表达
描述
pPROEX Aqua
青色
细菌
用n末端表达蓝宝石他的标签
Paquan1.
青色
哺乳动物
表达哺乳动物优化的海蓝宝石
mcerulean n1.
青色
哺乳动物
表达融合到单体天蓝色n端的感兴趣基因
mCerulean C1
青色
哺乳动物
表达融合到单体混凝器的C-末端的感兴趣的基因
mturquoise2.
青色
哺乳动物
将Mturquoise2靶向各种亚细胞室
pCEP4CyPet-MAMM
青色
哺乳动物
表达哺乳动物优化的CYPET
pcypet-his
青色
细菌
用C终端表达CYPET他的标签
SCFP3A
青色
哺乳动物
表达一个融合到SCFP3A c端感兴趣的基因
琥珀色N1.
黄色的
哺乳动物
表达对琥珀的N-末端融合的感兴趣基因
琥珀色C1.
黄色的
哺乳动物
表达一个与Amber的c端融合的感兴趣基因
mVenus N1
黄色的
哺乳动物
表达与单体金星的N-末端融合的感兴趣的基因
Mvenus C1.
黄色的
哺乳动物
表达融合到单体金星的C-末端的感兴趣的基因
pCEP4YPet-MAMM
黄色的
哺乳动物
表达哺乳动物优化的ypet
pYPet-His
黄色的
细菌
用c终端表达ypet他的标签
SYFP2
黄色的
哺乳动物
表达一个融合到SYFP2 c端感兴趣的基因
三叶草
绿色的
哺乳动物
表达mRuby2中常用的Clover (GFP变体)
PLSSMORANGE-N1
橙子
哺乳动物
表达一个融合到LSSmOrange n端的感兴趣基因
pLSSmOrange-C1
橙子
哺乳动物
表达一个融合到LSSmOrange c端的感兴趣基因
MRUBY2.
红色的
哺乳动物
表达了与Clover一起使用的mRuby2 (RFP变体)
pGWF1
青色和黄色
细菌
网关兼容的载体,表达ECFP和金星之间融合的感兴趣的基因

可能影响FRET测量的其他问题包括:荧光团对的亮度,供体:受体化学计量和两种荧光团之间的交叉谈话。FRET的专家建议使用具有相似亮度的两位荧光团 - 即使在最受欢迎的一对中,CFP也比YFP更少于亮度。供体的化学计量:受体难以解决,特别是当您调查未知的分子复合物时。但它是一个参数,即在分析FRET结果时必须记住。两种荧光团之间的串扰与其激发谱重叠相关联。如果在频谱中选择一对彼此靠近,则可以通过用于激发捐赠者的激光轻松直接激发受体。在这种情况下,串扰是高,并且您的背景信号可以高于通过能量传输产生的信号。相反,如果你选择一个离彼此太远的一对,你没有任何串扰,但你也没有任何共振转移。您必须在FRET效率和串扰之间找到平衡。

测量细胞生物学研究担忧的方法

几种方法在过去的20年里被使用过吗来衡量FRET,并没有一个比另一个更好。当首次为给定的实验建立FRET方法时,FRET专家经常建议尽可能多地使用可行的测量方法。然后,您可以为自己的系统选择最有效的方法。

最简单的和最流行的是敏化的发射方法,其中供体通过特定波长的光激发,并且通过使用为供体荧光的发射滤光器和受体荧光来收集信号。此外,如果FRET对之间没有串扰,这种方法可能是最佳选择。不幸的是,荧光团之间的串扰确实存在于现实世界和纠正方法和适当的方法中控制需要做到这一点该方法适用于FRET变化较大的动态实验。

另外两种方法通常用于测量FRET:受体光漂白方法及荧光寿命成像显微镜(FLIM)方法。

接受者光漂白方法

受体光漂白方法简单,但仅限于单一测量。这种方法是基于当FRET发生时供体被熄灭这一事实。通过光漂白受体,释放供体的猝灭,供体的荧光增加。这种方法是直接和定量的,但它是破坏性的,不能用于动态测量。应格外小心,以免破坏供体分子。

荧光寿命成像显微镜方法

FLIM是最近发展起来的,是测量FRET最严格的方法。FLIM测量供体的荧光衰减时间。当荧光猝灭发生在供体荧光对之间时,供体荧光猝灭,供体荧光衰减时间缩短,使FLIM能给出一个明确的荧光猝灭效率值。由于不测量受体荧光,这种方法对直接受体激发伪影也不太敏感,因此可以使用非荧光受体。值得注意的是,FLIM是一种较慢的成像方法,限制了它在许多FRET实验中的应用。此外,其他环境因素,如pH值或自身荧光背景,会改变荧光衰减时间,在解释数据时必须考虑。

FRET是20岁,但尽可能想象根本没有老式。随着新的荧光对的发展和较快的测量系统的出现,这种技术仍然有许多美好的日子和良好的“演出”前进......对BRET,CRET和其他RET技术没有冒犯,从未超出过师傅。


注意:

  • BRET =生物发光谐振能量转移

  • CRET=化学发光共振能量转移

关于FRET的有趣文章:

  • 活塞DW, Kremers GJ。荧光蛋白质:好的,坏和丑陋。趋势生物化学科学。2007年9月;32(9):407-14。

  • FRET基础和应用:一个EAMNET教学模块http://www.embl.de/eamnet/downloads/modules/FRET_teaching_module.pdf

  • Davidson MW日RN。vwin德赢娱乐平台荧光蛋白质用于微型显微镜:监测活细胞中的蛋白质相互作用。生物养殖。2012年5月;34(5):341-50。DOI:10.1002 / BIES.201100098。

  • Sekar RB, Periasamy A。活细胞蛋白质定位的荧光共振能量转移(FRET)显微镜显微镜成像。J细胞。2003年3月3;160(5):629 - 33所示。


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