vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:可光活化的荧光蛋白

由米歇尔克里琴

vwin德赢娱乐平台(FPS)为科学家提供一种简单而强大的方式来标记蜂窝蛋白,并调查蛋白质定位,相互作用和表达。然而,FP-蛋白融合(FP-Chimeras)的一种警告是它们经历正常的蛋白质转换。Fp-嵌合体在细胞内连续合成并降解,因此在任何给定的时间,FP-嵌合蛋白质可以是合成和降解的许多阶段中的任何一种。因此,使用标准的Fp-Chimecteric蛋白,几乎不可能确定特定的蛋白质周转或时间表达。

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可光活化的荧光蛋白(PA-FPS)vwin德赢娱乐平台是荧光蛋白,其在暴露于特定波长时显示其光谱性质的独特变化。PA-FP可以从低荧光状态激活到高荧光状态,它们可以从一个荧光颜色转换为另一个荧光颜色,或者它们的荧光可以可逆地接通和关闭。这种调节荧光的能力允许科学家观察单个荧光分子,否则会错过传统的FP成像。PA-FPS分为2个主要类别 - 那些不可逆转可逆光活化-并使复杂的成像技术成为可能。

光激活荧光蛋白的例子vwin德赢娱乐平台

不可逆光敏化

不可逆PA-FPs可以通过暴露在特定波长的光下,从暗淡或无荧光状态切换到更亮的荧光状态。开关或光电转换通常需要不到一秒的时间。第一个成功报道的不可逆PA-FP是PA-GFP。PA-GFP来源于水母(Aequorea victoria) GFP (wtGFP),通过将苏氨酸203突变为组氨酸T203H (1)。WTGFP.通常含有发色团的混合中性(质子化)和阴离子(质子化)形式的混合群,其有助于WTGFP激发光谱的2个峰 - 一个主要的397nm峰和次要的475nm峰。当用紫外线灯(〜400nm)照射WTGFP时,主要针对阴离子形式的发色团光转移,在用488nm的蓝光激发时导致荧光增加。PA-GFP中的T203H突变产生了更中性的发色团种群,导致PA-GFP在用488nm光线照射时显示几乎没有荧光。然而,当首先提出紫外线光时,它会使发色团的不可逆的光电转化从中性到阴离子形式,允许PA-GFP在用蓝光照射时表现出高达100倍的荧光增加(1)。

类似于PA-GFP,科学家稍后通过对增强的RFP变体进行几轮随机诱变筛选来开发红荧光PA-FPS。PA-MCHERRY(E26V / A58T / K69N / L84F / N99K / S148L / I165V / Q167P / L169V / I203R)(2)和PA-MRFP1(S146H / I161V / I197H)(3.)分别来自DSRED和MRFP。当用紫光灯照射时,两种变体都被光电逆转,以形成更亮的红色荧光。由于绿灯的发射更加光毒性对细胞,因此在体内成像模型中研究的大多数科学家们将PA-RFP脱颖而出。

另一类不可逆PA-FPs是可光腐蚀vwin德赢娱乐平台荧光蛋白(PC-FPS)。PC-FP可以从一个荧光颜色转换为另一个荧光颜色(例如,绿色到红色,或青色到绿色)。

例如,Meosfp(以希腊神话的黎明女神命名)从绿色切换到红色荧光。MeosFP暴露于紫外线,导致发色团附近的不可逆乳沟,导致红荧光的发射(4.)。EOSFP的二聚体或串联二聚体版本在单体中是优选的,因为MeOSFP发色团的形成需要低于30℃的温度,这对哺乳动物细胞的实验不理想。

Dendra2是另一个不同的单体PA-FP,与Meosfp不同,可以在更舒适的37°C下形成它的发色团(5.)。当暴露于蓝光时,Dendra2从绿色到红色荧光,这对Live组织的光毒性较少,而不是其他PA-FPS使用的UV光。已经发现了几种其他不可逆的PA-FP光谱变体,例如Kaede和PS-CFP2(见表1)。

表1:选择性不可逆光激活荧光蛋白的性质vwin德赢娱乐平台

蛋白质 低聚物的状态 激活光线 前/后的颜色 对比(荧光折叠变化) 亮度 激发/发射(NM)
PA-GFP. 单体 UV-Violet 深绿色 〜200 媒介 504/517
PS-CFP2. 单体 UV-Violet 青色/绿色 > 2000 媒介 490/511
kaede. 四聚物 UV-Violet 绿色/红色 〜2,000 高的 572/580
tdEos 串联 UV-Violet 绿色/红色 N/A 高的 569/581
梅奥斯 单体 UV-Violet 绿色/红色 N/A 高的 573/584
Kikgr. 四聚物 UV-Violet 绿色/红色 > 2000 高的 583/593
Mkikgr. 单体 UV-Violet 绿色/红色 560. 高的 580/591
Dendra2. 单体 紫外线或蓝色 绿色/红色 4,500 高的 553/573
Pa-mcherries. 单体 UV-Violet 深红 > 3,000 媒介 570 / 596.


可逆的光激活

与不可逆PA-FPs相比,可逆PA-FPs(也称为光开关)可以从暗状态光开关到亮荧光状态(“点燃”),从亮状态光开关到暗非荧光状态(“熄灭”)。光开关可以通过激活两个不同波长的光发生多次(见表2)。

最著名的可逆pa - fp是自然产生的Dronpa蛋白(以dron命名,在忍者里是消失的意思,pa是光活化的意思)(6.)。Dronpa通过光的蓝色波长光,引起绿色荧光的发射,但随后进一步暴露于蓝光也使发色团灭活,导致非荧光状态。通过接触UV光可以可逆地重新恢复Dronpa。蓝光激活和失活DronPa的事实并不理想,因为这意味着DronPa很快灭活,并且发射了较少的光子,导致调光器荧光。实际上,许多早期可逆PA-FPS也显示出这个“负”的照片开关。

2008年,科学家们通过诱变筛选发现了一种不那么快灭活的Dronpa。Padron是由Dronpa (T59M / V60A / N94I / P141L / G155S / V157G / M159Y / F190S)突变衍生的单体可逆PA-FP (7.)。Padron的“积极”切换行为与Dronpa相反;当暴露于蓝光时,PADRON从暗状态向激活状态光电,发出亮绿色荧光。当暴露于紫外线灯帕龙时,灭活。

RS-Cherries(8.)是另一组可逆的PA-FPs。这些被设计成第一个可逆的,单体的红色荧光PA-FPs。rcherry具有高的荧光背景,但是它们的单分子亮度和从暗态到红色荧光态的转换能力使它们可以用于绿色PA-FPs的双色成像。

表2:选择性可逆光激活荧光蛋白的性质vwin德赢娱乐平台

蛋白质 低聚物的状态 激活光线 前/后的颜色 对比(荧光折叠变化) 亮度 激发/发射(NM)
Dronpa. 单体

UV-Violet

深绿色 N / A(高) 高的 503/518
牧师 单体 蓝色的 深绿色 N / A(高) 低的 503/518
rsCherry 单体 黄色的 深红 7. 低的 572/610
RScherryrev. 单体 蓝色的 深红 20. 低的 572/610
FP595 四聚物 绿色 深红 70 - 1000 媒介 590 / 600.

为您的实验选择可光激活的荧光蛋白

类似于用标准FPS进行实验,在为实验选择PA-FP之前,有几个参数需要考虑,例如亮度光稳定性,pH稳定性,发色团成熟率为37°C,周转率和背景荧光水平。对于任何PA-FP应用,荧光更亮。更多荧光通常意味着发射更多光子,使得更容易捕获背景上方的清晰图像。

大多数PA-FPS有2种黄色和四聚体。四聚体PA-FPS对于整个细胞成像和研究细胞器贩运更好。通常优选用于研究单一蛋白质特征的单体PA-FPS,因为单体状态不太可能干扰内源蛋白质结构和功能。通过产生单体PA-FP,嵌合蛋白的含量较少oligomerize.,破坏细胞功能和定位,或导致蛋白质聚集。

需要考虑的另一个重要参数是对比度 - Phactivation前后PA-FP亮度的比较。高对比度通常表明,在不存在光活化的情况下,PA-FP具有低水平的自发荧光,导致增加的信噪比。具有更高对比度的PA-FP可以为您提供更容易解释的实验结果。

还应考虑用于激活PA-FP的光强度。如果激活所需的光强度太高,则在实验开始之前,光激活步骤实际上可以损害您的细胞!如果你正在表演多色实验,您将确保使用用于激活第一个PA-FP的灯不摄影第二个,反之亦然。最后,由于每个显微镜都有自己的怪癖(缩放,强度,可能的激发激光器水平),优化您的特定设置的激活协议也很重要。

光激活荧光蛋白的应用vwin德赢娱乐平台

PA-FPs的一些最重要的应用包括增强蛋白质、细胞器和细胞的光学活体成像。与FPs类似,PA-FPs允许非侵袭性标记,但相比之下,PA-FPs通过持续激发而降低了标准FPs可能引起的光漂白和光毒性。通过生成与细胞内蛋白质融合的PA-FPs,科学家可以追踪单个蛋白质的定位、周转和转运,以及细胞器的转运和动力学(裂变、融合等)。例如,通过工程将PA-GFP标记到线粒体基质蛋白(mito-PAGFP) 这Youle实验室能够在健康和凋亡细胞中可视化和量化线粒体的融合动态(9.)。

PA-FPS有助于彻底改变超分辨率显微镜的领域。PA-FPS,特别是单体,可逆式,非常适合于超分辨率成像,其中该技术的功率严重依赖于多次成像的相同荧光团以重建图像。用于超分辨率成像的最佳PA-FP通常具有以下特征 - 高对比度比,明亮的荧光,低自发激活以及两个荧光波长之间的光学开关。

实际上,在超分辨率显微镜的世界内,PA-FP已经帮助创建了几种新的成像方法,包括光激活定位显微镜(Palm,也FPALM)(11.)。对于PALM,一小块含有非活性PA-FPs的区域被光激活、成像,然后被光漂白。然后,额外的PA-FP分子以同样的方式被激活,直到足够的分子被分析出来,可以构建图像,提供细胞中详细的蛋白质定位信息。需要记住的一点是,尽管PA-FPs在超分辨率成像方面比传统FPs有了很大的改进,但它们仍然不能发射出与可光切换染料可实现的大量光子。

相关光镜和电子显微镜(CLEM)是一种成像技术,其将电子显微镜(EM)与荧光定位数据相结合。然而,该技术需要苛刻的固定条件以保护细胞结构(0.5-1%十六氧化锇)。这些条件破坏了大多数PA-FP,但是,在2015年,LoogerLAB设计了2个eosfp的变体,可以承受这些条件 -mEos4amEos4b12.)。两种变体比MEOS2更单体(MEOS4B是完全单体),并显示出明亮和光稳定的绿色和红色态。

超出这些成像应用程序的PA-FPS已开发用于使用酵母,作为…的一部分Biosenors., 以及更多。您对PA-FPS最喜欢使用吗?让我们在下面的评论部分中知道!

目前,科学界有20多种不同的PA-FPS,新的变体仍在设计。通过将PA-FP与超级化显微镜相结合,科学家现在拥有尖头探测蜂窝动力学和功能的工具,以非凡的分子细节。

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参考

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