了解使用TRUPATH的GPCR信令

Andrew Hempstead.

为了应对环境条件,细胞必须能够检测细胞外刺激。它们这样的方式是通过G蛋白偶联受体(GPCR),在信号传导过程中起许多作用的受体,包括气味,味道,视觉,炎症和神经递质。但大约950种不同的人类基因编码GPCRS(Takeda S等人,2002)和许多涉及的下游综合体,科学家们可能难以理解GPCR激活如何导致下游效果。

布莱恩罗斯的实验室创造了一种称为质粒的集合Tupath.为了询问可以在不涉及视线的GPCR的下游激活的16个非视觉G蛋白质信号传感器(统称为转晶体)的14个(olsenrhj等,2020)。换能器复合物由三个亚基的三聚体组成:α,β和γ(Gα,Gβ和Gγ),共同称为异映上G蛋白。该复合物将GPCR接收的信号转换为电池表面上的动作,以导致大量信令级联的启动,诱导不同的蜂窝响应。这种工具的最大优点之一是能够识别响应于感兴趣的GPCR的配体而被激活的特定换能器复合物。

Trupath如何工作?

Trupath集合允许研究人员测量不同Gα,Gβ和Gγ亚基的组合的物理协会。当非活动时,在与GPCR的细胞内表面结合的三聚体复合物中发现这些亚基。配体与GPCR细胞外表面的结合导致GPCR的构象变化,导致Gα亚基的激活。活化的Gα与GTP结合的GDP交换,导致来自Gβγ二聚体的Gα亚基的解剖,激活下游信号通路。

可以使用称为的技术测量该解离B.ioluminescence.R.骗子E.nT.Ransfer(BRET)。布莱特类似于FÖrster.R.骗子E.nT.Ransfer(FRET),其中供体荧光团用于激发受体荧光团。BRET的差异是能量转移位于发光供体和荧光受体之间。Trupath使用更新版本的BRET称为BRET2。

具有GPCR和换能器络合物的细胞膜的示意图。当GPCR结合配体时,换能器复合物解离导致布雷特的减少。下图表显示了药物浓度增加的布雷特减少。

图1:TRUPATH通过生物发光共振能量转移2或BRET2来测量异映上的G蛋白解离。具有药物的结合,α和β亚基解离得到的BRET2信号降低。随着药物浓度的增加,BRET2信号降低。

通过构建14个荧光素酶供体Rluc8-Gα嵌合体,四个受体GFP2-Gγ嵌合体和两个未标记的Gβ构建体来开发Trupath BRET2生物传感器系统。对于Gγ构建体,GFP2标签融合到蛋白质的N-末端。对于Gα构建体,RLUC8的本地化更具挑战性。Roth Lab使用的结构引导蛋白工程和实验细化来确定RLUC8插入在Gα内的最佳定位。尽管改进了详尽的细化,但对于16种非视觉G蛋白换能器中的两种,不可能产生最佳RLUC8-Gα构建体。

为了使用Trupath系统,用表达目的GPCR的质粒转染细胞,Gα-RLUC8质粒和适当的Gγ-GFP2和Gβ构建体。然后用发光酶底库酸酶处理细胞,然后加入内源性配体或药物。在非活动状态下,发光嵌合蛋白Gα-Rluc8和Gγ-GFP2将紧密结合,导致高水平的GFP2发射。在响应配体的激活之后,复合物将脱离,导致GFP2发射降低。激活状态可以通过BRET2比率测量,这是GFP2发射与RLUC8发射的比率(见图)。

Trupath可以用于什么?

Roth Lab在许多不同的实验方法中使用了Trupath质粒。他们首先评估了对不同激动剂的良好研究和升高的GPCR的传递体的不同成员的激活。这些研究表明,GPCR对不同的G蛋白换能器的滥交,并且对于特异性受体 - 配体对,效力和功效通常是不均匀的。它们进一步使用Trupath在单个GPCR上分析跨越阳阳OM的化合物面板,显示使用TRUPATH作为筛选技术的有效性。最后,可以使用Trupath系统测量拮抗剂和反向激动剂的活性。

结论

尽管GPCR途径的重要性是众所周知的,因此,由于许多药物的目标,仍然仅对GPCRS信号通过G蛋白质信号传感器的信号进行部分理解。Trupath系列提供了具有工具包的科学家,以了解通过来自不同GPCR的传输体的发信号。该系列可用于研究内源性配体,它们激活的途径,以及药物的激活以进一步了解其机制。这些质粒可用作收藏,促进筛选在传感器上,以获得对GPCR介导的反应的更完整的理解。

在这里找到Trupath Biosensor套件!

致谢

感谢罗斯实验室的研究生杰夫迪伯托,用于编辑博客文章。

参考

Olsen Rhj,Diberto JF,English JG,Glaudin AM,Krumm,Slocum St,Che T,Gavin AC,McCorvy JD,Roth BL,Strachan Rt(2020)Trupath,一种用于询问GPCR传感器的开源生物传感器平台。NAT Chem Biol 16:841-849。https://doi.org/10.1038/s41589-020-0535-8

Takeda S,Kadowaki S,Haga T,Takaesu H,Mitaku S(2002)从人类基因组序列鉴定G蛋白偶联受体基因。FEBS字母520:97-101。https://doi.org/10.1016/s0014-5793(02)02775-8

addgene博客上的其他资源vwin.com mobile

addgene.org的资源

话题:vwin德赢娱乐平台荧光生物传感器

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅