使用AAV进行神经元追踪

由克劳斯Wanisch.

神经元追踪的背景

理解大脑功能的关键方面是了解其架构,特别是不同脑区之间的连接。例如,海马与前额外皮层脑区之间的通信参与了情节内存的形成,一种特殊类型的存储器,包括自传事件(参见Jin & Maren, 2015年)。脑的不同部分之间的信息的定向流通过单独的神经元介导。神经元由细胞体组成,具有接收输入信息的枝形,以及将信息发送到其他神经元细胞的突出轴突。轴突终端的突触形成与近端神经元细胞的枝晶的连接。在情节记忆的具体实例中,海马神经元的一部分将轴突直接突出到前额叶皮质,也可以间接地通过其他脑区中的神经元突触。此外,区域之间的连接通常是倒数,形成在存储器形成和存储器检索期间被激活和加强的神经元环路。

神经元电路的例子

在神经元跟踪实验中,脑组织注射了细胞内散开的化合物,从施用部位远离施用和辅助,包括树枝状和轴突延伸的形态,最重要的是神经元对其他遥远的大脑的任何连接地区。期望在信息流方向上追踪化合物以概述神经元,以便理解哪个脑区域彼此通信以及它们的方式(即信号来自于它们的信令可能具有哪些含义)。前后追踪从其细胞体概述神经元到轴突的终端;虽然逆行跟踪追踪相反方向的神经元,但从轴突的端子到其细胞体。

前译和逆行跟踪

前卫和逆行跟踪利用神经元现有的交通途径。前者传输通常用于贩运细胞器,例如线粒体,以及肌动蛋白和肌球蛋白等大分子,以及用于发射器合成的酶。逆行传输用于运输内吞的材料或靶向降解的分子。这两种途径也使用不同的细胞骨架机械进行促进运输:逆行传输依赖于Dynein,而前者传输依赖于Kinesin。各种形式的逆行和前者传输的不同速度速度表明,有几种并行机制到位(审查见Maday等,2014)。目前不清楚哪种蛋白质促进神经元描绘化合物的运输,这是需要进一步研究的区域。

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传统的神经元追踪方法

传统的示踪化合物要么产生比色产品,要么具有荧光。虽然染料通常是单向分布的,但也有一些报道是双向分布的。生物素化的右旋糖酐胺(Veenman et al., 1992)或荧光分子等用于主要的顺行示踪rhodamine-isothiocyanate(RITC;灭霸等,1987)。对于主要的逆行示踪,用辣根过氧化物酶(HRP;Kristensson and Olsson, 1971),植物凝集素(小麦胚芽凝集素使用WGA, Schwab等人,1978年)或荧光分子,如Fluoro-Gold (Schmued和Fallon, 1986年)。

促进细胞对这些染料的吸收在活的有机体内可以应用显微注射,压力注射或离子电渗疗法(通过插入电极施加小电流),但这些方法可以对细胞健康产生负面影响。传统追踪化合物的另一个限制是它们对突触裂缝的扩散通常严重受损,并且在染料分子上仅存在少数报告,该染料分子在导致微弱信号的突触处从一个神经元转移到另一个神经元(Schwab等,1979;Buttry&Goshgarian,2015年)。尽管如此,在过去的几十年中使用这些示踪剂对于建立目前对神经内膜和神经连接的理解至关重要,为神经元通信提供有价值的见解。

斑马雀大脑的逆行标记

vwin668病毒载体和神经系统

出现病毒矢量技术,研究神经元连通性的新方法已经发展起来。这些方法具有较少的神经毒性,并与其他神经科学方法(如电生理记录)更好地兼容。这些方法的起源是自然发生的病毒,这些病毒感染、持续存在并在神经元内迁移,它们也能够在突触连接中传播。最著名的是狂犬病病毒(RABV)它从外周感染部位逆行转移到中枢神经系统,在那里进行复制、传播,引起神经毒性,如果不加以治疗则是致命的(综述见Dietzschold等人,2008)。单纯疱疹病毒(HSV)也可以通过神经元迁移,在那里它可以复制,并通过这种方式在几个突触连接中传播(Ugolini等人,1989)。当使用这些病毒标记神经元连接时,由于病毒的持续复制,大部分神经元细胞都被标记。虽然这很有用,但如果标记的神经元太多,就很难准确地映射网络连接(Lo & Anderson, 2011)。

在过去的二十年里,一些病毒种类被修改并被用作追踪工具。与一些工程,RABV和HSV,但也包括伪狂犬病毒1型,水泡性口炎病毒(VSV;Beier等人,2011),腺病毒,adeno相关病毒(aav),已被用于追踪和可视化运动、视觉和听觉神经回路在活的有机体内。一个变体RABV被开发成只通过单一突触步骤标记神经元连接,从而阻止RABV的进一步广泛扩展。这种改善导致了哺乳动物大脑中神经元连接的更清晰的图像(Wickersham et al., 2007;addgene的质粒)。

AAV向量:提供神经元示踪剂的平台

由于AAV载体在脑研究方面的优势,以及将遗传物质引入神经元细胞的能力,一段时间以来,已经被神经科学家广泛使用。AAV基因组是单链DNA分子,AAV载体具有复制缺陷(即它们不能像天然RABV或HSV那样容易在细胞间传播)。AAV没有像慢病毒一样的膜包膜,而是被衣壳所包含,衣壳由病毒蛋白VP1、VP2和VP3组成。到目前为止,已有数百种变异(或血清型)通过自然或基因工程的方式被发现在衣壳蛋白质上存在差异。要了解一个简短的概述,请参阅Addgene 'sAAV指南

AAV颗粒的尺寸相对较小(20nm),使得它们能够在细胞外空间中扩散;它们还具有低免疫原性和细胞毒性。AAV载体可以配备强促进剂,用于高和神经元特异性转基因表达。vwin德赢娱乐平台广泛用于跟踪,它们通常是出现的Cre-dependent。如果在只在特定细胞类型中表达Cre的转基因动物中使用Cre依赖的载体,例如只在多巴胺能神经元中表达Cre,那么神经元追踪具有额外的好处,即只标记也表达Cre的受感染细胞子集。AAV载体的另一个优点是,它们的生产和纯化有成熟的方案,可以产生高滴度的抗体生产纯化滴定法在Addgen网站上)。

组织 最佳血清型
CNS. Aav1, aav2, aav4, aav5, aav8, aav9
AAV1,AAV8,AAV9
AAV7,AAV8,AAV9
AAV4,AAV5,AAV6,AAV9
RPE(视网膜颜料上皮) AAV1,AAV2,AAV4,AAV5,AAV8
骨骼肌 Aav1, aav6, aav7, aav8, aav9

表1:常见的AAV血清型及其靶组织(适应Addgene AAV指南

常用的血清型包括AAV1 - 9,其中大多数这些血清型能够进入神经元(见表1)(Choi等,2005; Taymans等,2007; Howard等,2008; Watakabe等,2015)。有几条关于逆行和前型AAV血清型的逆行和蒽咯的内部传输的报道,但总体而言效率相当低。并非所有运输效率的措施都是一致的,这可能是由所用技术,种类和脑区域的多样性引起的。AAV1,-2,-5,-7,-8(Taymans等,2007),AAV1(Hollis等,2008)Aav6(Towne等,2010),AAV8,-9(Masamizu等,2011);AAV5(Aschauer等,2013)。AAV1,-5,-8(MCFarland等,2009)和AAV1,-8,-9(Castle等,2014)的双向传输,已观察到前驱传输。AAV血清型之间的差异也可以与细胞和病毒生命周期中的未涂覆步骤相关的差异。

使用AAV进行神经元追踪

小鼠脑内75个神经元的形态和位置AAV vectors是许多神经科学家的首选,许多组使用它们来映射神经元网络。Kohara等人。2014年跟踪神经元,具有表达CRE依赖性荧光标记的AAV9载体。注射到条件突变小鼠脑中,其仅表达CRE重组酶的CRE重组酶CA2,用于详细绘制学习和记忆所涉及的神经元电路(Kohara等,2014;addgene的质粒)。

加州理工学院的GradInaru实验室生成了表达几种不同荧光蛋白(红色、绿色、蓝色)之一的新型aav (Chan et al., 2017)。vwin德赢娱乐平台如果研究人员将这些不同的AAV载体混合注入大脑区域,AAV粒子将以不同的比例感染神经元,使这些神经元发出不同颜色的荧光。然后,根据单个神经元独特的颜色(addgene的质粒)。

具有AAV载体的神经元描绘的大型示例是艾伦小鼠脑连接地图集,一个映射小鼠脑中神经元连接的项目。对于这个项目,AAV1被用作持前示踪剂,并在整个小鼠脑中注射了几百个网站。跟踪神经元在整个大脑上关闭或远端的区域表示荧光标记物,允许以统一和标准化的方式可视化(Oht Al。,2014。,2014年)的前所未有的连接数或“连接”。)。可以在这项研究中产生的图像可以找到艾伦小鼠脑连接阿特拉斯网站

来自Janelia Campus的研究人员使用类似的方法,为他们的竞争项目,但神经元与AAV2追踪。双光子成像用于在小鼠脑中产生一定的神经元的3D Finemap。可以在鼠标上找到mouselight图像m娇网网站

小鼠大脑AAV逆行标记Janelia Research Campus的加州大学加州大学的科学家们还开发了一个新的AAV变体RAAV2-RETRO,率较高的速率比任何其他AAV血清型(Tervo等,2016;质粒在Addgene)。与传统的染料示踪剂相比,它的效率可与传统的染料示踪剂相媲美,同时与化学示踪剂相比,它还具有更低的毒性、更高的特异性和更低的技术可变性等优势。rAAV2-retro对肝素的亲和力也较低,这可能解释了它不太可能被隔离在细胞外空间的原因。此外,rAAV2-retro改变的氨基酸序列可能促进与摄取或细胞内运输机制的相互作用。Addgene提供AAV2复古载体的病毒制剂具有多种转基因/启动子组合。看看我们逆行AAV博客帖子

网络可视化的另一个理想特性是能够通过突触向随后的神经元扩散。AAV载体不具备复制能力,不能像RABV或HSV那样通过复制传给后续细胞。然而,也有一些关于部分AAVs跨突触扩散的报道,特别是逆行方向的AAV6和顺行方向的AAV2 (Salegio et al., 2013)。Zingg et al. 2017也提供了AAV1和AAV9能够突触扩散的证据。trans-synaptic贩卖的潜在机制不完全清楚,可能是一种transcytosis AAV粒子在哪里拿起一边的细胞并再次释放另一侧的细胞胞内运输后不引起感染或导致细胞内第一个转基因表达。虽然病毒粒子总是有沿着轴突在细胞外空间扩散的风险,但AAV1和AAV9似乎都不是这样。值得注意的是,AAV9被证明通过内皮胞浆吞噬穿过血脑屏障(Foust et al., 2009;默克尔等人,2017年),这两种交通方式可能有共同的机制。这些罕见的观察结果可能是未来AAV载体领域发展的起点。

结论

神经元描绘和网络识别的理想综合工具集需要翼展和逆行标签,突触限制以及控制的单腹和多腹蔓延。AAV向量涵盖这些属性中的一些,并且它们的使用允许在啮齿动物大脑中可视化单个连接网络。更好地了解AAV内部传输的路线和机制可以促进更强大的AAV血清型的发展,也许导致AAV载体的控制变突触蔓延。还可以通过使用致敏转基因与条件转基因小鼠组合来实现改进的神经元描绘,以揭示神经元连接的解剖学,而是为了可视化功能相关的神经元连接,即活动依赖性神经元追踪。除了映射神经元网络之外,如果可以以较少的侵入性方式到达大脑的受影响部分,改善的AAV载体也可能是基因治疗领域的强大工具。例如,在神经肌肉疾病中,希望通过靶向外周结构(例如注射肌肉)来实现转基因递送,而不是直接的脑内施用,这更为侵入性,并且具有更高的并发症风险。


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