病毒基因组测序 - AAV身份和血清型确认的一站式商店

由Meghan Rego.

梅根雷科

我们的质量控制(QC)Mantra的主要原则之一是尽最大努力确保科学家正在接受他们认为它们的确切材料。要解决这个问题,几年前我们与之合作SEQWELL.建立一个下一代测序(NGS)QC平台这使我们能够提供具有完全质粒序列的科学家。在2016年推出viral服务后,我们调整了这个平台以适应腺相关病毒载体(AAV)样本并创建了一种简化的过程,称为病毒基因组测序(VGS),以确认我们AAV准备的身份和血清型。我们最近发布了对VGS过程和用例的描述人类基因治疗

AAV质量控制现有方法

从历史上看,AAV矢量QC一直稀疏,包括AAV粒子的滴定和蛋白质染色评估纯度。对于产生少量AAV准备的实验室,这种水平的质量控制足够但对于病毒载体核心设施并行产生大量病毒制剂,存在混合样品,血清型或两者的非常真实的风险。不幸的是,标准AAV QC方案没有解决这个问题。

以前的研究表明,NGS是确认AAV载体基因组身份的有效工具。这些研究使用了SMRT测序基于TA的结扎基于标记的AAV基因组测序的方法(TAI 2019; LECOMTE 2015; Maynard 2019)。遗憾的是,目前SMRT测序仅适用于自互补AAV,并且先前描述的基于TA的连接和标签制备方法需要初步双链步骤。假设双链步骤是必要的,因为AAV基因组是单链的,并且基于TA的连接和标签需要双链模板。

使用病毒基因组测序来验证病毒基因组

我们假设这种双重搁浅步骤实际上是不必要的。自从此以来AAV基因组存在为[+]和[ - ]股在相同的频率下封装,我们推理,在DNA提取之后,[+]和[ - ]链可以自然地赋予形成一种双链物种,其可用作下游应用的模板(伯尔尼,1972)。使用基于QPCR和限制酶的方法,我们表明DNA提取物是单链和双链物种的异质混合物。虽然不是DNA提取物中的所有分子与互补链相关联,但混合物中存在足够的双链物质,以用作基于标记的文库制备程序的有效底物。该发现消除了双链步骤,减少了AAV基因组测序的时间和成本。

一种解释病毒基因组测序步骤的流程图。它从纯化的AAV开始,然后DNA提取和提交NGS,最后生物信息学分析
图1:病毒基因组测序工作流程。

使用这种简化的方法,我们在100 AAV矢量准备中测序,并显示VGS可以快速可靠地确认AAV基因组的身份并检测污染AAV DNA。另外,我们写了一个开源自定义Python脚本这利用VGS数据确定CRE依赖性载体中存在的重组百分比和可以确认AAV准备的血清型的脚本。

使用病毒基因组测序来确定血清型

AAV包装并不完美,虽然我们认为AAV向量基因组仅包含我们所需要的表达式磁带,但它还包括来自包装细胞系,助手和包装质粒的少量寄生DNA。我们决定通过设计在数据中查找预定义的Serotype特定签名序列的Python脚本来利用这一点。与之前描述的不同基于热力学的血清型核实方法,这种方法不需要任何额外的试剂或实验室工作(Pacouroet,2017)。此外,来自多个AAV批量的测序数据可以并行运行,并在几分钟内提供Serotype数据,并且可以容易地定制脚本以检测其他感兴趣的序列。

虽然VGS进程对Addgene没有新的,但我们很高兴与实验室和病毒载体核心分享程序和Python脚本,常规地产生AAV。我们认为,这种简化的测序和分析方法可以很容易地纳入标准的QC方案中,并将提供科学家,以至于他们的研究材料正是他们认为的所在的急需保证。

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参考

Berns Ki,Adler S(1972)分离两种类型的腺相关病毒颗粒含有互补多核苷酸链。J Virol 9(2):394-396。

Lecomte E, Tournaire B, Cogné B, Dupont J-B, Lindenbaum P, Martin-Fontaine M, Broucque F, Robin C, Hebben M, Merten O-W, Blouin V, François A, Redon R, Moullier P, Léger A (2015) Advanced Characterization of DNA Molecules in rAAV Vector Preparations by Single-stranded Virus Next-generation Sequencing. Molecular Therapy - Nucleic Acids 4:e260 .https://doi.org/10.1038/mtna.2015.32

Maynard LH,Smith O,Tilmans NP,Tham E,Hosseinzadeh S,Tan W,Leenay R,May Ap,Paulk NK(2019)Fast-SEQ:一种简单的方法,用于快速和廉价验证包装的单链腺相关病毒学术环境中的基因组。人类基因治疗方法30:195-205。https://doi.org/10.1089/hgtb.2019.110

Pacouroet S,Bouzelha M,Shelke R,Andres-Mateos E,Xiao R,Maurer A,Mevel M,Turunen H,Barungi T,Penaud-Budloo M,Broucque F,Blouin V,Moullier P,Ayuso E,Vandenberghe LH(2017年)AAV-ID:用于AAV准备的批量批量一致性评估的快速和稳健的测定。分子疗法25:1375-1386。https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.04.001

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