vwin668病毒载体101:部分AAV转移质粒

由Beth Kenkel.

所以你有了这个很棒的实验,但它需要一些AAV。你以前从未与AAV合作过,但你不会让它阻止你。你从哪里开始?就像所有优秀的实验一样,制造AAV从一些质粒开始。你只需要三个质粒就可以开始了制作AAV.:

  1. 包装质粒其中包含结构和包装基因,
  2. adenoviral辅助质粒其中含有病毒复制所需的蛋白质,
  3. 转移质粒其中包含病毒基因组。

在当今的博客文章中,我们将专注于AAV转移质粒,看看每个部分。

含有病毒基因组的AAV病毒。这就放大到了AAV病毒基因组的标记。病毒基因组最大为4.4 kb,包括一个ITR、启动子和转基因基因。选项元素有LoxP站点、WPRE和pA。
图1:AAV转移质粒部分。绿色部分为AAV质粒的关键成分。灰色部分是可选顺式调节元件。

AAV质粒的关键元件

首先让我们谈谈AAV质粒的关键部分。

反相终端重复(ITR)序列

倒置终端重复(ITRS)是使AAV转移质粒成为AAV转移质粒的原因。ITR序列是145个碱基,每个碱基具有两个ITR序列。ITRS之间的DNA序列是将包装成AAV分子的序列。在ITRS之外的内容不会在AAV向量中包装。ITRS之间的克隆能力为〜4.4 kB。

由于其二级结构、回文性质和高GC含量,itr本身是不稳定的。这种不稳定性会导致常规质粒传播过程中ITR的部分丢失,而ITR的完全丢失将使AAV包装失效。为了防止ITR损失,最好在重组缺陷菌株(如Stbl3s)中传播AAV构建体。ITR损失可以通过酶的限制性消化检测,如smi,它在ITR中有识别位点。由于itr的二级结构和高GC含量,常规的Sanger测序通常无法通过itr进行测序,但一些公司现在提供了Sanger测序条件,可以读取这个具有挑战性的序列。

转基因

转基因是AAV将递送的基因。在质粒图上,其序列位于ITR之间。只要它是〜4.4 kB或更小,就可以就像你喜欢的任何东西。一些例子包括记者喜欢GFP,一些较小的CRISPR-Cas蛋白质,如SaCas9CRISPR gRNAs,或者你感兴趣的基因。

启动子

启动子驱动AAV基因的表达。在质粒图上,启动子位于它们所控制基因的上游或5 '端。启动子可以是生物或组织类型特定的,这可以帮助你限制你的转基因表达到一个特定的物种或位置。启动子也可以驱动不同水平的表达。例如,CAG是一个强大的启动子,驱动非常高的,普遍的表达,而人类Synapsin 1启动子是神经元特异性的(Haery等,2019)。大多数AAV转移质粒都有启动子,但如果转移质粒含有非编码序列,则不需要启动子。

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其他顺式调节元素

接下来让我们谈谈任何不需要AAV转移质粒的部分的元素,但经常在它们中看到。

液态氧的网站

Lox位点,结合Cre重组酶,用于在空间和时间上控制转基因表达。Lox位点是定向的34 bp序列,位于转基因侧翼和itr之间。转移质粒通常有两对lox位点,这是双lox系统的一部分,称为柔性或者戴奥。

REX位点被重组酶CRE识别。克雷先flips在第一对lox站点之间的序列,然后前任切出第二对之间的序列。最终的结果是一个永久翻转的转基因。通过限制Cre的可用性,lox位点可以让研究人员控制转基因的空间和时间激活。

CRE-LOX.
图2:FLEX creo - lox系统。

毒液

The Woodchuck肝炎病毒(WHP)翻译调节因素(WPRE)在转录时形成三级结构,这有助于MRNA的核导出,有助于增加转基因的表达。WPRE位于AAV基因组的末端,在最终ITR的上游。

多元

多聚腺苷酸化或多聚a信号有助于RNA的核输出和RNA翻译,并促进RNA转录延长。polyA位于AAV基因组的末端,位于最终ITR的上游和WPRE的下游。

TL,博士?观看我们的AAV转移质粒视频!

现在你已经对一些常见的AAV质粒元素有了一个基本的了解!虽然还有许多其他的AAV质粒元素和组合没有在这篇文章中讨论,但你已经获得了能够设计一个成功和具体表达你感兴趣的基因的构造的知识。


参考

Haery L,Deverman,Matho Ks,Cetin A,Woodard K,Cepko C,Guerin Ki,Rego Ma,Ersing i,Bachle Sm,Kamens J,Fan M(2019)adeno相关病毒技术和针对目标神经元操纵的方法。前神经内坦特13:。https://doi.org/10.3389/fnana.2019.00093

Wilmott P,Lisowski L,Alexander Ie,Logan GJ(2019)用户指南到adeno相关病毒的反相终端重复。人类基因治疗方法30:206-213。https://doi.org/10.1089/hgtb.2019.276

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