原位可视化蛋白质营业额

由Guest Blogger.

神经元这篇文章由Guest Blogger,Eugenia Rojas提供贡献。

一个值得博士学位的问题:你如何在神经元内显示蛋白质周转?

对于我的博士学位,我研究了一个与之相关的突触蛋白神经变性。阿尔茨海默病患者的脑大脑中该蛋白质的水平降低。但是,尚不知道为什么或此发生这种情况。因此,我开始研究蛋白质营业额如何在神经元中受到调节。

蛋白质转化是蛋白质合成和降解的综合作用。这些过程控制细胞中蛋白质的丰度。植物对蛋白质丰度的稳态调节对于正常细胞功能至关重要,并且因为我正在研究突触蛋白,我想测量其正常神经元背景下的水平。换句话说,我需要一种可视化蛋白质营业额的方法原位在神经元。

学习蛋白质成交量的经典方法是放射性脉冲追踪实验。然而这些实验是有问题的,因为它们需要放射性标记的氨基酸。使用放射性物质的使用受到高度监管,需要指定的工作区域并具有健康风险。重要的是,通过这种方法,不可能遵循单个蛋白质的成交量原位。

用于特定蛋白质的可视化原位免疫细胞化学也许是最常见的方法。具有良好且特异性的抗体和适当的显微镜设置,我们可以观察在神经元或任何其他细胞类型中的一个特定蛋白质的整个群体。但是,我们无法区分从该池中的旧蛋白质中的新蛋白质。因此,不可能可视化蛋白质合成的定位。

或者,荧光蛋白的标签可用于促进细胞中特定蛋白的可视化。标记蛋白可以容易地从质粒过表达,但过表达可能会干扰系统。研究蛋白质合成的另一种方法原位是荧光标签的敲入感兴趣的基因轨迹。这种替代方案的优点是实时成像的可能性。罗伯特歌手在Albert Einstein医学院的实验室最近发表了在生活单细胞中进行翻译的技术。但是,在之前CRISPR-CAS9.这些技术非常繁琐,甚至在这里,标签是否影响行为的问题。

会议和突破!

在我的研究生学习期间,我参加了一个称为地平线的科学研讨会。这次年度研讨会由国际博士学生在Max Planck Biophysical Chemistry研究所,德国Göttingen。我参加了这个研讨会,寻求灵感来解决特定蛋白质监测蛋白质营养额的技术汹涌原位。当我参加教授的一个非常有趣的谈话时,我好运erin m schuman.是一名前CALTECH研究人员,现在是德国法兰克福MAIN MAIN MAIN MAIN Max Clance研究所的Max Planck脑研究所主任。她介绍了一部小说技术,然后仍未发布,允许特定的可视化德诺维合成蛋白质原位。我很荣幸被邀请在法兰克福的MPI中向他们学习,并进行类似的实验。

用FUSCAT可视化新合成的蛋白质

舒曼教授的技术采用非甘露糖氨基酸,氮杂卟啉(AHA)应用代谢标记。在该技术中,AHA掺入新合成的蛋白质代替甲硫氨酸中。可以使用共价将含有Aha的Azido与荧光alkyne标签连接到荧光alkyne标签中的咔哒化学来检测标记的蛋白质。然后用荧光显微镜观察新合成和标记的蛋白质。AHA标签的这种应用称为F思韵Noncanonical.一种小酸T.衰老(Funcat,Dieterich等。自然神经科学,2010年)并允许可视化整体德诺维合成蛋白质组。然而,单独的Funcat不能用于确定一种特异性蛋白质的营业额舒曼教授的实验室表明,通过将其与接近结扎测定(PLA)相结合,可以扩展Funcat的有用性以确定特定蛋白质的营业额。

Funcat和PLA的巧妙组合

PLA最初由Söderberg实验室在瑞典作为一种可视化蛋白质 - 蛋白质相互作用的方法原位。在标准PLA测定中,向怀疑相互作用的迄今为止的两个内源蛋白的一抗被添加到细胞样品中。两种抗体都有一个短抗体特异性DNA链。仅当感兴趣的蛋白质彼此紧密接近,DNA链才能参与滚动圆DNA扩增。扩增的DNA区段用荧光探针标记,使得能够可视化蛋白质 - 蛋白质相互作用的位置。

研究蛋白质水平原位,Schumann Lab使用了PLA的修饰版本,其中一种抗体朝向感兴趣的蛋白质,但第二抗体针对AHA。现在,如果两种抗体识别出在确定的时间段的脉冲标记之后也掺入AHA标签的内源性蛋白质,则只能发生滚动圆扩增。因此,仅检测到新合成的兴趣蛋白,并通过Funcat-PLA来观察。

Funcat PLA.

在组合这些方法之前,不可能可视化具体新合成内源性蛋白质原位。现在Funcat-PLA提供了关于任何细胞类型中特定内源蛋白的换档的定量和时空信息。exc


非常感谢我们的博客,尤金罗哈斯!

Eugenia Rojas.Eugenia Rojas,PHD是一种神经科学家,他们一直对神经生物学深受感兴趣。她对传达科学对所有受众的热情。现在,她是一个科学讲师波士顿的创新研究所当尤金尼亚不是被显微镜的时候,她喜欢旅行,发现新餐馆,去音乐会和烘烤。你可以联系她rojas@ti2learning.org.

参考

1. Dieterich,Daniela C.等人。“在大鼠海马神经元新合成蛋白的原位可视化和动态。”自然神经科学13.7(2010):897-905。PubMed.PMID:20543841。pmed中央PMCID:PMC2920597

2。Nathans,Daniel。“嘌呤霉素抑制蛋白质合成:将嘌呤霉素掺入肽链中。”国家科学院的诉讼程序51.4(1964):585-592。PubMed.PMID:14166766。pmed中央PMCID:PMC300121.

3.Söderberg,奥拉,等。“通过邻近结扎直接观察单个内源性蛋白质复合物。”自然方法3.12(2006):995-1000。PubMed.PMID:17072308

4。蒂克,汤姆,等。“原位直接可视化新合成的靶蛋白。”自然方法12.5(2015):411-414。PubMed.PMID:25775042。pmed中央PMCID:PMC4414919.

5。YAMOLINSKY,MICHAEL B.和L. Gabriel。“氨基酸嘌呤含掺入蛋白质的嘌呤粘合。”国家科学院的诉讼程序45.12(1959):1721-1729。PubMed.PMID:16590564.。pmed中央PMCID:PMC222790.

6。Buxbaum,Adina R.,Bin Wu和Robert H. Singer。“神经元中的单β-肌动蛋白mRNA检测显示了调节其相位性的机制。”科学343.6169(2014):419-422。PubMed.PMID:24458642。pmed中央PMCID:PMC4121734

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