vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:当GFP让您失望时

客人的博客

本文由客座博客Joachim Goedart撰稿,Joachim Goedart是阿姆斯特丹大学分子细胞学和先进显微技术van Leeuwenhoek中心的助理教授。

绿色荧光蛋白是最受欢迎,最广泛使用的遗传编码荧光探针。有几个因素导致GFP的普及包括(i)在几乎所有生物和细胞类型中的功能性,荧光蛋白快速和完全成熟,(ii)无需添加配合因子,(iii)与标准滤波器集合易于可视化在荧光显微镜上,最后(iv)融合蛋白的良好耐受性。

由于GFP是一种经过充分验证、性能优良的探针,因此在选择基因编码荧光标记时,它是首选。但是,如果您选择使用它,可能会遇到一些限制。下面将讨论这些限制和可能的解决方案。

GFP有许多变体。这里我使用“GFP”这个名称,它指的是mEGFP。该变种是通过在原始的水母GFP (AvGFP)中引入两个突变(F64L, S65T)来产生增强型GFP (EGFP),这是一种亮度更高的变种(Tsien,1998年)。另一个突变(A206K)是产生严格单体EGFP变体MEGFP(Zacharias等人,2002年)。

GFP需要氧气

发色团形成需要完全折叠的β-桶结构,然后产生发色团的分子内反应(Tsien,1998)。重要的是,该反应需要分子氧,因此GFP在厌氧条件下保持非荧光。这对任何AVGFP和珊瑚衍生的荧光蛋白保持了真实。因此,GFP不适合需要厌氧条件的应用。vwin德赢娱乐平台

在需要厌氧条件的实验中,可以使用结合内源性荧光辅助因子的蛋白质。例如结合黄素的LOV结构域(Buckley等人,2015年)或结合胆红素的UnaG蛋白(Kumagai 2013)。在这些自然发生的辅助因子结合蛋白旁边,已经设计了蛋白质结合合成的荧光类似物的系统(刺,2017)。这些荧光类似物通常被添加到沐浴液中,需要被细胞吸收。这些策略中哪一个对厌氧条件下的特定生物系统最有效,需要逐个检查。

GFP对酸敏感

GFP的发色团可以以质子态和去质子态存在(Tsien, 1998)。脱质子态的吸光度最大值约为488 nm,其发光峰值为508 nm。然而,质子态不吸收488纳米处的光。这两种状态之间的比率反映在pKa上,GFP约为6.0。这个数字表明,在pH值为6时,仅有50%的可用绿色荧光蛋白发光。vwin德赢娱乐平台

的pKavwin德赢娱乐平台可准确确定在体外通过测定纯化蛋白在不同酸浓度下的荧光强度。不同荧光蛋白的pKa值可参看(Cranfill等人,2016FPBASE.ORG.)。许多变体在酸性条件下仍具有荧光,pKa值低于4。例如mTurquoise2 (pKa = 3.1), tagRFP (pKa = 3.1)和mCherry (pKa = 3.8)。我们观察到mCherry(和mTurquoise2,未显示)在酸性细胞器(图1),表明其耐酸能力在细胞内得以维持。

耐酸荧光蛋白在溶酶体中保持荧光vwin德赢娱乐平台

GFP很大

GFP是一种28kda的蛋白质,它类似于一个长4.2 nm,直径约2.4 nm的圆柱体(Hink等人,2000年)。完整的β-桶是其荧光所必需的,因此不能通过删除残留物来缩小GFP。只有大约10个氨基酸可以从N-末端从C末端和约5中删除,但这几乎没有降低其尺寸。GFP的大小可以干扰融合蛋白的活性或定位。此外,在感兴趣的蛋白质相对较小的情况下,添加GFP可以改变扩散速率。

较小的遗传编码探针基于如上所述的辅因子结合蛋白。最小的标签是肽,其被设计成特异性和对荧光团的高亲和力结合。例子是FlAsH标签他的标签和其他一些。另一种基于肽的策略是使用一种酶用荧光团共价标记肽。这两个系统都是基因编码的标签和外部添加的组件的混合体。查看回顾Lotze等。(2016)。迄今为止,完全遗传编码的小探针不存在,但非天然荧光氨基酸的发展及其掺入蛋白质中的掺入方向(Chatterjee等人,2013;Hilaire等人,2017)。

GFP只能用于标记蛋白质

GFP融合蛋白是通过将其DNA密码与编码另一蛋白质的cDNA连接而制成的。有效地,它为目标蛋白质配备了一个额外的蛋白质模块,可以报告位置。这种方法能够研究细胞中的蛋白质,但不能研究其他感兴趣的生物分子,如DNA、RNA和脂质。尽管如此,这些分子可以通过使用蛋白质结构域来间接地可视化,这些蛋白质结构域专门结合感兴趣的分子。例如,pleckstrin同源域可以用于检测特定的磷酸肌醇(Varnai和Balla, 2008)(图2)

通过使用一种MS2外壳蛋白可以检测到RNA的产生,该蛋白可以特异性地检测到特定的RNA干环结构(Querido和Chartrand,2008)。最后,核酸酶缺陷的Cas9可以结合gRNA定义的基因组中的位点。由于Cas9是一种蛋白质,与GFP的融合可以检测基因组位置(Chen等人,2013)。

GFP融合脂质结合域磷酸肌醇

GFP荧光与自身荧光重叠

用于激发GFP的青色光也可以激发几种天然存在于细胞或介质中的组分。这些“自身荧光”的来源包括含有哺乳动物细胞中含有蛋白质的培养基或黄素中的核黄素。通常,当激发波长移位到更长波长时,自发荧光较小。因此,使用亮红色荧光蛋白(例如Mscarlet)或红外荧光蛋白(vwin德赢娱乐平台Chernov等人,2017)可以改善检测。由于较长的波长具有更好的组织穿透能力,(红外线)红色荧光蛋白对于较厚的样品也是一个更好的选择。vwin德赢娱乐平台

另一种避免自身荧光的方法是生物发光蛋白。这些探针通过化学反应产生光,因此,没有必要激发样本。虽然生物荧光探针通常比荧光探针昏暗,但最近的工程努力增加了这些基因编码的光发射器的亮度。Takai 2015Iwano等人。,2018年)。

我的融合中不耐受绿色荧光蛋白

标准做法是将绿色荧光蛋白连接到另一个蛋白质的N-或c -末端。然而,这可能会干扰蛋白质的功能。当蛋白质用脂肪酰基链进行翻译后修饰时,这显然是一种情况。例如,肉豆蔻酰化需要n端一致序列(MG-),而丙烯酰化需要c端一致序列(- caax)。当GFP与这些序列融合时,这两种修饰都会中断。

当N端和c端融合不能被耐受时,另一种方法是将GFP插入目标蛋白的编码序列中。这种方法效果良好的原因之一是,GFP本身的N端和c端相对接近,从而最大限度地减少了对目标蛋白的破坏。通过这种方式,我们(和其他人)成功地产生了几种功能异三聚体g - α亚基融合,它们不耐受N-和c -末端融合(Adjobo-Hermans 2011)。结构信息有助于选择适当的站点,尽管它仍然是生成多个变体并检查融合功能的功能(Mastop 2018)。

概括

GFP是一种全面有效的基因编码探针,但也有其局限性。意识到这些限制对于成功使用GFP或任何其他荧光蛋白vwin德赢娱乐平台。幸运的是,许多局限性都有解决方案,而GFP的替代方案的数量预计会随着众多科学家全世界的不断努力而产生的不断扩大的遗传工具箱。


非常感谢我们的客座博主Joachim Goedhart!

joachim_100px.Joachim Goedhart是分子细胞学和面包车部分的助理教授列文虎克高级显微镜中心(阿姆斯特丹大学)。他开发、鉴定并使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart

参考

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