什么时候单体不是单体?您最喜欢的荧光蛋白在细胞中寡发的三种方式

由Guest Blogger.

GFP多重化

这篇文章是由Guest Blogger提供的贡献erik l. snapp.

停止使用EGFP / GFP进行融合蛋白!尽管有很多高质量的期刊文章,许多研究者仍然不知道EGFP/GFP易于形成非共价二聚体。EGFP的这种特性可能导致重要的人工制品。

如果你使用了绿色荧光蛋白或增强的绿色荧光蛋白(GFP / EGFP)用于转录记者或作为细胞的一般细胞质标签,没有问题。你没关系。但是,如果您将您的兴趣蛋白(POI)融合给GFP,以研究蛋白质在细胞中的行为,在解决方案中,您正在使用具有严重缺点的标签。用于由Clontech出售的标准EGFP质粒,并在世界上每个实验室销售的冰箱盒子并不惰性。在所有严重性中,EGFP / GFP具有真正的非计量倾向,无共度二聚体。这意味着您的POI融合到GFP或另一种荧光蛋白(FP)可以在细胞中形成二聚体。你为什么要关心?下面列出了三种简单的方式,Dimeric FP可能会破坏您的一天(和实验)。解决方案以避免这些常见问题。

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这是一个浓度问题

大多数fps本质上都易于二聚化(即EAGFP)[12,甚至形成专性四聚体(即DsRed) [3.]。这是融合蛋白的问题。FPS的主要应用是可视化POI的本地化,动态和行为。作为调查员,您希望将融合标签惰性,不要在实验中产生伪影。相当大的努力已经进入了FPS单体,但许多调查人员仍然无知的FP二聚体。同样有问题的是,报道的几种单体FPS实际上不是单体,至少在实际术语中。特定类型的分子形成二聚体的倾向取决于其分子亲和力,称为解离常数或K.D.,它的浓度。较小的K.D.,特定类型的分子相互作用的可能性就越大。一种含有纳摩尔的蛋白质K.D.将主要作为细胞中的二聚体存在,而具有高微摩尔或低毫米的蛋白质K.D.不太可能在细胞中形成二聚体。这K.D.为0.11 mM [2]。在上面概述的简单逻辑之后,您可能认为EGFP不太可能在单元格中形成二维数。不幸的是,事情并不那么简单。

浓度是体积内的分子数。在许多生物学研究情况中,相关体积是细胞的。对于与分子浓度相关的物理行为进行精确预测,假设分子在整个体积中均匀分布,并且可以在720°中自由地翻滚。However, if the molecules are confined to a subregion of the cell and/or they cannot tumble in 720°, i.e. they are on a membrane or in an organelle, then their effective concentration will be much higher than if they are homogenously distributed and mobile throughout the cell. If two copies of a molecule are part of a single fusion protein, as in aFRET BIOSESSOR.然后围绕该融合蛋白的局部浓度的FPS非常高。下面描述这些细胞中这些情况的实际实例(见图1)。

GFP二聚化可能引起的问题

1.跨膜荧光蛋白融合

跨膜蛋白,即受体和转运蛋白,集成到脂质双层中。FP对跨膜蛋白的融合显着增加了FP的有效浓度。FP被限制在平面上,通常仅在360°中旋转,增加两个FPS将彼此碰撞的概率。后果可能是戏剧性的。对于定位于内质网的膜POI,小管的类似蜘蛛网样图案可以严重变形成致密堆叠膜,如果将FP与POI融合,则掺杂有组织的光滑的内质网或OSER。这些结构大(微米),明亮,非生物,难以忽视[12]。

2.融合到迫使少量或低聚物

几种细胞蛋白通常自递合到同型二聚体或甚至更高阶的低聚物中。遗憾的是,与POI二聚化耦合的FP二聚化可以导致融合蛋白的聚合。二聚体融合蛋白将具有两个FP结合结构域,形成足以种子聚合物形成的建筑物,因为融合蛋白浓度增加。作为结果的聚合融合蛋白通常将不正确定位并且可以不正确地定位。

3.结合到FRET Biosensor中

一种FRET BIOSESSOR.是一个经历一致性变化的记者,将两种FPS在单一的蛋白质上放在一起或进一步分开。距离的变化改变一个FP到非相交能量到第二FP的能力,通常会降低来自第一FP的荧光信号并增加来自第二FP的信号。用CFP和YFP,青色和EGFP的黄色变体进行几种早期褶皱生物传感器,同样能够将其作为EGFP二聚化。结果,CFP和YFP二聚体可以在没有环境变化的情况下形成,使得生物传​​感器设计用于检测产生误报[24.]。

对聚合物问题的解决方案

研究人员有一些简单的解决方案,可以处理所有这些问题。最简单和最佳的解决方案是使用真正的单体FPS。EGFP和其他GFP家族成员(超级胶凝箱,祖母绿,CFP,YFP,BFP,Cerulean,绿松石,金星)可以用A206K突变单独制成单项化[2]。Addgene有很多这些构造它们被指定为mGFP, mVenus等。需要注意的是,因为非GFP衍生的FPs(即红色FPs)不一定是单体的,即使它们在出版物中被描述为单体。测定蛋白质是否单体的金标准是沉淀平衡分析超离心法[2]。用于描述上面的FPS的纸张中使用的一些亲和力测定,包括分子尺寸柱和天然凝胶不能检测EGFP二聚化。重要的是,所有这些测定都进行了体外。检测FP二聚化的测定体内细胞环境,如CytERM螺旋形成试验,是二聚电位的实际测量方法,它将决定FP在实验相关环境中是否会二聚。有关更详细的讨论,请参阅[5.]。

问题1和2取决于蛋白质浓度。不完美的解决方案是将成像分析限制对表达融合蛋白的最低水平的细胞。这可以减轻诸如EGFP的中等诸如EGFP的FPS的伪像,但不适用于例如DSRED或高亲和力FPS,例如TAGRFP。在大多数情况下,可以通过使用来自不同家族的单体FPS或FPS来解决问题3,其不能形成异二聚体(即EGFP和MCHERRY)。这些简单的策略可以帮助您为您的学习做出更好的荧光融合蛋白记者,并大大降低找到艺术成果的机会。


非常感谢我们的嘉宾Blogger Erik L. Snapp!

埃里克·L SnappErik Lee Snapp在俄勒冈州卫生科学大学的分子微生物学和免疫学中获得了他的博士学位,他的博士后奖学金与詹妮弗·莱宾·施瓦茨(Jennifer Lippincott-Schwartz)是国家卫生研究院,他目前是Albert Einstein医学院副教授在解剖学系和结构生物学。他的兴趣包括内质网和活细胞成像方法中分泌蛋白质的质量控制。Erik也是狂热的长途跑步者,加德纳和厨师。

参考文献

1. snapp,e.l.等。,通过低亲和力蛋白质相互作用形成堆叠的ER CISTernae。J Cell Biol,2003。163.(2):p。257-69。PubMed.PMID:14581454。pmed中央PMCID:PMC2173526

2. Zacharias,D.A.等人,将脂质改性的单体GFP分配成活细胞膜微粒子。科学,2002年。296.(5569): 913 - 6页。PubMed.PMID:11988576.

3. Matz,M.V.等人,vwin德赢娱乐平台来自非双硫化的荧光蛋白,非双硫化的AnthozoA物种。Nat Biotechnol,1999。17.(10):p。969-73。PubMed.PMID:10504696.

4. ohashi,T.等。,基于GFP的FRET的实验研究,施用到本机非结构化蛋白质。蛋白质SCI,2007年。16.(7):p。1429-38。PubMed.PMID:17586775。pmed中央PMCID:PMC2206698.

5. Costantini,L.M.等。,评估生理条件下荧光蛋白在荧光蛋白的趋势。vwin德赢娱乐平台交通,2012年。13.(5):p。643-9。PubMed.PMID: 22289035。pmed中央PMCID:PMC3324619.

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