用斑马鱼推进生物学:发育研究的基因工具及更多

由Guest Blogger.

本文由博士后研究员凯瑟琳·罗杰斯提供Friedrich Miescher实验室的最大普朗克社会。

斑马鱼成人斑马鱼(Danio Rerio.)自20世纪30年代以来一直用于一系列生物学研究,包括对环境污染与健康、胚胎生长、大脑功能和疾病发展的调查。为什么斑马鱼会成为如此受欢迎的模范生物?

斑马鱼(图1)最初被认为是一种有用的脊椎动物模型,基于它们直接的饲养和产生大量、外部受精、透明后代的能力(图2)。这些特征使它比其他脊椎动物模型(如老鼠)更有优势(或鳍向上?)它们的产量更少,维持每个个体的成本更高。与小鼠不同的是,这种透明的斑马鱼胚胎是在母体外发育的,这使它们成为研究脊椎动物胚胎发生的理想选择。

为了说明斑马鱼被纳入模型生物的一些原因,我将概述一些可用的遗传资源,并突出了从斑马鱼的调查产生的发展生物学中的两个突破。

斑马鱼身上可见的血管

斑马鱼的遗传资源

一种常见的方法来解开驱动生物学的基因网络是检查操纵基因的后果。作为模型生物的斑马鱼成功的一个原因是其对遗传操作的可致力。关于基因操作的工具以及关于基因组的信息是调查任何生物过程的强大资源。

高质量的基因组序列

高质量的序列组装斑马鱼基因组发表于2013年,揭示了大约70%的人类基因在斑马鱼中有一个对应的。了解鱼类中这些基因的功能将有助于澄清他们在人类的角色。测序的基因组还允许“全基因组/转录组”研究,其中,例如,可以监测所有基因的所有基因的活性可以监测。这可以揭示基因的先前未知的功能,并为理解将过程从发育的基因网络调节到生育能力的基因网络。

几种斑马鱼特异性基因表达数据库提供有关的信息在哪里基因在发育胚胎中是活性的。额外的分析工具已开发用于帮助以有用的方式解析和可视化表达式数据。

斑马鱼突变体

在20世纪90年代,两次革命性的大规模随机突变筛选产生了约1500种斑马鱼突变体,这些突变体仍在全球实验室中使用(Nüsslein-Volhard et al., 2012)。一个例子是独眼的针头突变体,调节与先天性心脏缺陷和癌症有关的发育途径。这些突变体被广泛用于研究发育和疾病。另外的诱变项目已经启动,今天数以千计的基因突变影响不同的生物过程-不仅仅是发展-可以从菌株分布中心我们欧洲,中国。此外,斑马鱼模型生物体数据库ZFIN积极策划关于突变体和其他资源的信息。

针对斑马鱼的目标基因失活工具

随机诱变屏幕为了解基因控制生物学(由此庆祝的事实)提供了一个主要的脚趾诺贝尔奖委员会)。但是,随着遗传学领域的发展和基因组序列的出现,关于特定基因相互作用的新的假设出现了,需要工具来使特定基因失活。

利用锌指核酸酶、TALENs和最近的CRISPR/Cas9,已经在斑马鱼中证明了靶向突变。斑马鱼中另一种流行的靶基因失活方法是被称为morpholinos的短修饰寡核苷酸。当注入受精卵时,与靶mRNA互补的morpholinos通过阻断起始或剪接抑制其转译。(相比之下,RNAi是通过现有的基因调控机制来阻断活性的,在斑马鱼身上并不容易起作用。)Morpholinos是一种方便快捷的方法来灭活基因,而不需要花费数月的时间来产生突变。出乎意料的是,有时表型的不同取决于基因是通过突变还是morpholino失活。这一发现开启了一项新的研究遗传的补偿,先前未知的基因调控机制(El-Brolosy等,2019)。

生成斑马鱼基因转移

通过将异物DNA引入基因组来产生转基因生物可用于各种应用。例如,可以荧光标记诸如血细胞或神经元的特定组织,从而允许研究人员在不同的实验条件下观察对这些组织的变化。策略产生转基因斑马鱼建立得很好(Felker和Mosimann,2016)。一个常见和强大的策略使用称为rserposonTol2将外源DNA随机整合到基因组中。使用利用噬菌体整合酶phiC31的替代方法,也可以实现非随机整合到特定的预先确定区域。流行的UAS/Gal4和Cre/Lox基因调控系统也已成功应用于斑马鱼。

利用斑马鱼谱系追踪的发育生物学洞见

为了突出斑马鱼有用的一些特性,我将概述两种最近的谱系追踪方法,它们导致了发育生物学的重要见解。

基于显微镜的谱系追踪

经过24小时的时间,外部受精的斑马鱼受精卵转变成一个有机体,它有一个明确的身体计划,包括头、眼睛和尾巴。与不透明的老鼠胚胎相比,斑马鱼是观察胚胎发生的理想系统,类似的过程在母亲体内会发生好几天。斑马鱼胚胎中的成千上万个细胞的起源、分裂和运动已经被证实跟踪使用Microscop.y和高级计算方法(Keller et al., 2008)。这种基于显微镜的谱系追踪在时间和空间上定义了早期胚胎发生的高分辨率地图,也被用来精确地描述发育缺陷独眼的针头随机突变筛选的突变体。基于显微镜的谱系追踪可以帮助阐明信号通路——比如那些由独眼的针头在胚胎发育期间对组织和器官的“雕刻”共同。

核标记斑马鱼胚胎的SiMview显微镜观察基于单细胞序列的谱系追踪

最近,使用单细胞映射了显影斑马鱼胚的所有细胞中的基因表达核糖核酸测序方法(Harland,2018)。已经开发了几种不同的方法,依赖于既定试剂,如CRISPR / CAS9,Tol2以及高质量的斑马鱼基因组测序。一项研究对来自694个胚胎的38731个细胞进行了分析重建了基因活性和细胞分裂模式该坐标的人体计划的发展(Farrell等,2018)。本研究还表明,在没有信号通路的情况下独眼的针头,产生不正确的正常细胞类型的比例,而不是新颖的异常细胞类型。基于测序的谱系追踪可以帮助阐明将Zygotes转化为成人的基因网络,并解释了信号通知途径如何控制该过程。

斑马鱼的其他应用和结论

斑马鱼在发育生物学之外也很受欢迎,尤其适合于神经科学研究。例如,神经元活动可以整个大脑都在游泳,积极学习幼虫,将前所未有的观点提供参与决策等认知过程(Kim等,2017)。“大脑彩虹“已经开发了鱼类线以通过独特的标记神经元实现大脑的高分辨率映射。斑马鱼也适合操纵脑活动:optogenetic方法可以用来确定激活或沉默活的幼虫的特定神经元的后果。此外,斑马鱼已经成为成功的疾病模型,并被用于研究人类疾病,如血液疾病、糖尿病、癌症和阿尔茨海默氏症。

自然,最好的生物模型取决于生物学问题,斑马鱼并不是每种应用的理想选择。缺点包括:与无脊椎动物模型系统相比,它们重复的(即多余的)基因组、长达3个月的生成时间和劳动密集型的维护,以及它们(到目前为止)对容易的CRISPR/ cas9介导的外源DNA插入的抗性。

尽管有这些警告,斑马鱼的一些特征——包括可用的遗传资源和胚胎的透明度——在各种研究应用中被证明是有用的。谱系追踪研究强调了这些优势如何转化为发育生物学的见解,在斑马鱼的帮助下,这一领域和其他领域的进展可能会继续下去。


非常感谢我们的客座博主凯瑟琳·罗杰斯Friedrich Miescher实验室的最大普朗克社会。

凯瑟琳·罗杰斯·马克斯·普朗克凯瑟琳W.罗杰斯是弗里德里奇帕特里克米勒集团的博士后研究员
马克斯普朗克学会米舍尔实验室,Tübingen,德国。她研究脊椎动物
开发使用致敏方法。

参考文献

El-Brolosy, Mohamed A等人。突变信使rna降解引发的基因补偿自然杂志568.7751(2019):193。PubMed.PMID: 30944477

Farrell, Jeffrey A等人。斑马鱼胚胎发生过程中发育轨迹的单细胞重建科学360.6392 (2018): eaar3131。PubMed.PMID:29700225。pmed中央PMCID:PMC6247916

Felker,A.和C. Mosimann。“当代斑马鱼转基因与托管2和CRE / LOX重组实验的应用。”细胞生物学方法。卷》135。学术出版社,2016年。219 - 244。PubMed.PMID:27443928

哈兰德,理查德M。胚胎发育和再生的新观点科学360.6392(2018):967-968。PubMed.PMID: 29853675

凯勒,Philipp J,等。用扫描光片显微镜重建斑马鱼早期胚胎发育科学322.5904(2008): 1065 - 1069。PubMed.PMID:18845710

Kim, Dal Hyung等。“自由游动的斑马鱼中具有细胞分辨率的泛神经元钙成像。”自然方法14.11(2017):1107PMID:28892088

Nusslein-Volhard,克丽丝汀。“发展中的斑马鱼问题。”发展139.22(2012):4099-4103。

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